2. Mục ựắch của ựề tài
1.5. Một số hiểu biết ựại cương về vắcxin
1.5.1. định nghĩa
Vắc xin là một chế phẩm sinh học trong ựó chứa chắnh mầm bệnh hoặc kháng nguyên của mầm bệnh gây ra một bệnh truyền nhiễm nào ựó cần phòng (nếu là mầm bệnh thì phải ựược giết hoặc làm nhược ựộc bởi các yếu tố vật lý, hóa học và sinh vật học). Khi sử dụng cho ựộng vật, vắc xin tạo ra một ựáp ứng miễn dịch chủ ựộng giúp ựộng vật chống lại ựược sự xâm nhiễm của mầm bệnh tương ứng.
1.5.2. đặc tắnh cơ bản của một vắc xin
Một vắc xin phải ựảm bảo 4 ựặc tắnh cơ bản:
- Tắnh sinh miễn dịch: đó là khả năng gây ra ựáp ứng miễn dịch dịch thể hay tế bào hoặc cả hai. Nó phụ thuộc vào tắnh lạ của kháng nguyên hoặc ựường ựưa kháng nguyên và cơ ựịa của mỗi cá thể ựộng vật.
- Tắnh kháng nguyên hay tắnh sinh kháng thể: Một vắc xin khi ựưa vào cơ thể phải có khả năng kắch thắch cơ thể sinh ra kháng thể.
- Tắnh an toàn: Sau khi sản xuất vắc xin cần ựược kiểm tra chặt chẽ bởi cơ quan kiểm ựịnh nhà nước vể mặt vô trùng, vô ựộc, thuần khiết.
- Tắnh hiệu lực: Nói lên khả năng bảo hộ ựộng vật sau khi tiêm vắc xin.
1.5.3. Các loại vắc xin
* Vắc xin chết hay bất hoạt: Là chế phẩm mà vi sinh vật ựộc hại ựược vô hoạt bằng hoá chất hoặc nhiệt, có tắnh ổn ựịnh an toàn nhưng hiệu lực kém, thời gian miễn dịch ngắn.
* Vắc xin nhược ựộc: Là chế phẩm mà các vi sinh vật gây ra bệnh ựược nuôi cấy ở ựiều kiện ựặc biệt nhằm làm giảm ựộc lực của chúng.Vắc xin này tạo thời gian miễn dịch dài ổn ựịnh nhưng cần thận trọng khi bảo quản và sử dụng
* Vắc xin thế hệ mới: Vắc xin tái tổ hợp, DNAẦ.
1.5.4. Nguyên lý
Vắc xin tạo ra trong cơ thể sống một ựáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt ựộng, sinh ra kháng thể dịch thể ựặc hiệu hoặc kháng thể tế bào chống lại những nhóm quyết ựịnh kháng nguyên của yếu tố gây bệnh, cơ thể sử dụng vắc xin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu ựược chủ ựộng nhân tạo có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng.
1.5.5. Một số ựiều cần chú ý khi sử dụng vắc xin
Vắc xin là thuốc thường ựược dùng cho ựộng vật khoẻ mạnh hoặc chưa mắc bệnh. Nếu dùng cho ựộng vật ựã nhiễm bệnh thì làm cho bệnh phát sớm hơn và nặng hơn.
Trường hợp ngoại lệ có thể dùng vắc xin cho ựộng vật ựã nhiễm bệnh như người bị chó dại cắn.
Vắc xin phòng bệnh nào thì chỉ phòng cho bệnh ựó.
Hiệu lực vắc xin phụ thuộc vào tình trạng sức khoẻ của ựộng vật nó là kết quả ựáp ứng miễn dịch của ựộng vật. Vì lẽ ựó chỉ dùng vắc xin cho ựộng vật khẻ mạnh ựược chăm sóc nuôi dưỡng tốt, không mắc bệnh truyền nhiễm và mãn tắnh, ựể tạo ựược miễn dịch tốt nhất.
Cũng cần chú ý thêm rằng trong ựộng vật ựạt tiêu chuẩn tiêm vắc xin không phải tất cả ựều sinh miễn dịch tốt. Có một số ựộng vật do ựiều kiện ngoại cảnh có thể sinh miễn dịch kém không có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của của mầm bệnh và vẫn mắc bệnh. Tỷ lệ ựộng vật tạo ựược miễn dịch chống lại bệnh gọi là hiệu giá bảo hộ hay chắnh là hiệu lực của vắc xin.
Thời gian tạo miễn dịch: Thường sau khi sử dụng vắc xin sau 2-3 tuần mới sinh miễn dịch. Trong thời gian 2-3 tuần ựó ựộng vật vẫn chưa có miễn dịch ựầy ựủ nên vẫn có thể nhiễm bệnh và mắc bệnh. Hiện tượng ựó có thể gây ra những nhận ựịnh sai lầm cho rằng vắc xin không có hiệu lực hoặc vắc xin gây ra phản ứng, vắc xin gây bệnh.
Chất bổ trợ của vắc xin: Bổ trợ keo phèn gọi là vắc xin keo phèn, bổ sung dầu khoáng gọi là vắc xin nhũ dầu.... Cần lắc ựều trước khi sử dụng
Liều sử dụng: Cần sử dụng vắc xin theo ựúng chỉ dẫn ghi trên nhãn lọ. Nếu tiêm liều thấp hơn liều quy ựịnh thì sẽ làm giảm quá trình ựáp ứng miễn dịch, còn nếu cao hơn liều quy ựịnh thì sẽ làm tê liệt miễn dịch hoặc gây phản ứng. Vắc xin vi khuẩn phải tắnh theo tỉ trọng, vắc xin nhược ựộc thì tiêm liều giống nhau cho mọi lứa tuổi.
Số lần dùng vắc xin: khi dùng vắc xin lần ựầu thì ựộng vật sớm nhất sau một tuần mới có ựáp ứng miễn dịch nhưng hình thành kháng thể chưa nhiều và giảm ựi rất nhanh. để tránh nhược ựiểm ựó người ta tiêm nhắc lại mũi hai cách mũi một sau 3-4 tuần. đáp ứng miễn dịch lần này sẽ mạnh hơn và kéo dài hơn.
Sau ựó ựể duy trì ựáp ứng miễn dịch và nâng cao sức miễn dịch thì cứ 4- 12 tháng lại tiêm nhắc lại một lần tuỳ theo vắc xin, tuỳ theo ựộng vật và tuỳ theo tình hình dịch tễ.
Bảo quản vắc xin: Phải ựể trong ựiều kiện quy ựịnh, ựây là ựiều ựặc biệt quan trọng quyết ựịnh chất lượng và hiệu lực vắc xin.
Các ựiều kiện bảo quản vắc xin: để ở nhiệt ựộ 2- 80C, ở nhiệt ựộ này có thể bảo quản vắc xin ựúng theo hạn dùng ghi trên nhãn, nếu không ựúng thì sẽ rút ngắn hoặc mất hiệu lực. Không ựể vắc xin ở chỗ nóng có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, vì như vậy vắc xin sẽ mất hiệu lực. Khi mở lọ vắc xin ra phải dùng ngay. Không ựể vắc xin ở ựộ lạnh âm vì ảnh hưởng ựến chất lượng vắc xin, làm biến dạng nút cao su, tạo kẽ hở dễ hút ẩm và lẫn tạp.
PHẦN II
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
- Khảo nghiệm ựánh giá chất lượng và ổn ựịnh của vắc xin phù ựầu sau quá trình sản xuất.
- Theo dõi thực nghiệm vắc xin ở các hộ chăn nuôi.
2.2 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
2.2.1 Các loại môi trường, hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu - Kháng huyết thanh xác ựịnh kháng nguyên F4 chuẩn do Nhật Bản cung - Kháng huyết thanh xác ựịnh kháng nguyên F4 chuẩn do Nhật Bản cung cấp theo chương trình dự án JICA tại Viện Thú y.
- Huyết thanh bê vô trùng do tổ sản xuất huyết thanh chuyên trách tại ựơn vị cung cấp.
- Môi trường sản xuất vắc xin: BHI, Meat Extract, Yeast Extract, Nutrion broth của hãng sản xuất Merk (đức).
- Môi trường thạch máu. - Thạch thường.
- Thạch nấm.
- Thạch MacConKey
- Nước thịt, nước thịt gan yếm khắ.
- Các loại môi trường: sacchaarose, lactose, glucose, galactose, maltose, fructose, manitol, dextrose.
- Mẫu vắc xin phòng bệnh phù thũng lợn với tên gọi là vắc xin phù ựầu do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Thú y - Viện Thú y TW sản xuất.
- Chất bổ trợ Al(OH)3 GEL. - Chất phá bọt Antifoarm 204. - Phèn chua.
- Acid H2SO4 5%, NaOH 1N. - Hóa chất thắ nghiệm khác.
2.2.2 Các máy móc sử dụng trong quá trình nghiên cứu
- Hệ thống máy lên men sục khắ Bioflo 5000 sản xuất tại USA trang bị tại phân xưởng vắc xin Vi trùng.
- Hệ thống lọc huyết thanh vô trùng. - Bình cầu, bình tam giác.
- Máy kiểm tra pH Metter. - Máy ly tâm, pipet,..
2.2.3 Các ựộng vật dùng trong nghiên cứu
- Lợn thắ nghiệm giai ựoạn 14 - 90 ngày tuổi, nuôi trên ựịa bàn huyện Tiên Lữ - tỉnh Hưng Yên, ựược kiểm tra không có kháng thể kháng E.coli gây bệnh phù thũng lợn.
- Chuột bạch khỏe mạnh, trọng lượng 18-20g/con, do bộ phận chuyên trách chăn nuôi ựộng vật sạch của Viện Thú y TW cung cấp.
2.2.4 Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn E.coli dùng ựể sản xuất vắc xin ựược Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú y nghiên cứu và phân lập ựược. Sau ựó bằng công nghệ PCR TS. đỗ Ngọc Thúy bộ môn vi trùng ựã xác ựịnh ựược các yếu tố kháng nguyên quyết ựịnh ựến khả năng gây bệnh và chọn ra bộ giống chuẩn gồm 5 chủng E.coli.
Hiện tại giống ựược giao cho Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và chuyển giao công nghệ Thú y giữ và cung cấp tại ban giữ giống. Giống bao gồm 5 chủng vi khuẩn ký hiệu lần lượt là: EC1, EC2, EC3, EC4, EC5. Tất cả các chủng ựều mang các yếu tố gây bệnh là ựộc tố LT, ST, VT2e và các kháng nguyên bám dắnh F4, F18, F4 + F18, các chủng trên ựều gây dung huyết ở các mức ựộ + + ựến + + +.
Tất cả các chủng trên ựều có khả năng giết chết 100% chuột trong vòng 15 Ờ 18 giờ, giết lợn từ 42 - 58h. Các chủng trên hoàn toàn ựảm bảo các ựiều
kiện sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh phù thũng ở lợn do vi khuẩn E.coli
gây ra.
2.2.5 Vắc xin sử dụng trong thắ nghiệm.
Vắc xin phù ựầu phòng bệnh phù thũng ở lợn do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Thú y sản xuất. Mỗi liều vắc xin chứa 4- 4.5 tỷ kháng nguyên thân của vi khuẩn E.coli, nhiệt ựộ bảo quản 20-80C, hạn sử dụng 10 tháng kể từ ngày sản xuất in trên bao bì. Vắc xin tiêm cho lợn bằng con ựường tiêm dưới da, liều 1ml/con lúc 14 ngày tuổi.
2.3. đối tượng nghiên cứu.
Vắc xin phù ựầu do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Thú y Ờ Viện Thú y TW sản xuất theo sự chuyển giao công nghệ của Bộ môn Vi trùng.
2.4 địa ựiểm nghiên cứu.
- đề tài ựược thực hiện tại Trung tâm nhiên cứu ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Thú y - Viện Thú y.
- Một số cơ sở chăn nuôi tại huyện Tiên Lữ - tỉnh Hưng Yên.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp xác ựịnh hiệu giá kháng thể F4 bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà ngưng kết hồng cầu gà
- Chuẩn bị: Kháng nguyên, hồng cầu gà 0.3%.
- Cách tiến hành: Kháng thể (huyết thanh lợn ựã tiêm vắc xin) ựã chuẩn bị ựược pha loãng với nước sinh lý theo hệ số 2 từ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16,Ầ. Trên tấm nhựa 96 lỗ ở nhiệt ựộ phòng. Dung tắch mỗi lỗ chứa 0.25 micro lắt kháng thể ựược pha. Cho vào mỗi lỗ kháng nguyên ựã dược pha loãng bằng 0.25 micro lắt. Sau ựó cho vào mỗi lỗ dung dịch hồng cầu gà ựã chuẩn bị ở phần trên. đậy nắp ựể ở nhiệt ựộ 40c, ựọc kết quả sau 2 giờ. Phản ứng âm tắnh khi hồng cầu ngưng kết như ựối chứng âm, phản ứng dương tắnh khi hồng cầu lắng xuống ựáy như ựối chứng dương.
2.5.2 Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu ựược lấy theo lô vắc xin, mẫu là các lọ vắc xin sau khi ra chai chứa 10 liều/ lọ.
- Mẫu ựược lấy theo phương pháp ngẫu nhiên với tỷ lệ sau: Mỗi lô vắc xin có trên 500 sản phẩm trở nên chúng tôi sẽ lấy 15- 20 lọ ựể kiểm tra theo quy ựịnh. Sau khi lấy mẫu ựược ghi chép về: Thời gian lấy, người lấy, ngày sản xuất, số lượng, ựiều kiện bảo quản.
2.5.3 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
- Kiểm tra sự tạp nhiễm vi sinh vật.
Áp dụng theo Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y của Cục thú y (1994).
a. Mỗi lô vắc xin ựược kiểm tra trên các môi trường với số lượng sau: + 2 ống môi trường thạch máu (Blood agar).
+ 2 ống môi trường nước thịt(BHI). + 2 ống thạch nấm (Sabouraud agar). + 2 ống môi trường nước thịt gan yếm khắ.
b. Các loại môi trường trên ựược chế từ môi trường chế sẵn ựược cung cấp bởi hãng sản xuất Merk (đức). Các loại môi trường trên dùng ựể phát hiện các loại vi sinh vật có trong vắc xin. Mẫu vắc xin ựược cấy vào môi trường kiểm tra có khối lượng bằng 1-2% thể tắch môi trường.
d. Môi trường ựã cấy kiểm tra ựược theo dõi từ 7-10 ngày ở nhiệt ựộ 370C. e. đọc kết quả
Mẫu vắc xin ựược xem là ựạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
2.5.4 Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu an toàn theo phương pháp phân lô, phân ựàn phân ựàn
Dựa vào quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vắc xin dùng trong Thú y của Cục Thú y (1994)[4] , chúng tôi ựã tiến hành theo cách sau:
* Phương pháp thay thế:
Chọn 20 chuột bạch, trọng lượng 18 Ờ 20 gram, khỏe mạnh, không có kháng thể E.coli tương ứng, chia làm 2 lô:
- Lô thắ nghiệm: Gồm 10 chuột, mỗi con ựược tiêm 0.5 ml vắc xin (liều gấp 2 lần liều miễn dịch).
- Lô ựối chứng: 10 chuột không tiêm vắc xin.
Vắc xin ựạt chỉ tiêu an toàn khi cả 2 lô chuột ựược theo dõi ắt nhất 10 ngày, không có bất cứ phản ứng bất thường nào ở vị trắ tiêm hoặc triệu chứng lâm sàng của bệnh do vắc xin gây ra.
* Phương pháp thử trên bản ựộng vật:
Chọn 60 lợn khỏe mạnh, lứa tuổi 2, 4 và 6 tuần tuổi chia làm 2 lô: - Lô 1: Mỗi lứa tuổi của lợn chọn 10 con, tiêm 2ml/ con/lứa tuổi.
- Lô 2: Mỗi lứa tuổi của lợn chọn 10 con, sau ựó tiêm 3ml/ con/lứa tuổi. Theo dõi phản ứng sau khi tiêm ắt nhất 10 ngày, vắc xin ựạt chỉ tiêu an toàn khi không có phản ứng bất thường nào trên ựộng vật thắ nghiệm trong thời gian theo dõi.
2.5.5 Phương pháp kiểm tra hiệu lực.
Dựa vào Ộhồ sơ ựăng ký sản xuất vắc xin E.coli phù ựầu lợnỢ[16] ựược Cục Thú y cấp phép 3/2003 lưu giữ tại ựơn vị về việc kiểm nghiệm hiệu lực của vắc xin phù ựầu, chúng tôi ựã tiến hành theo cách sau:
Vắc xin ựược kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp:
* Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường ựộc trên ựộng vật thắ nghiệm:
- Lô thắ nghiệm: Mỗi lô vắc xin chọn 10 chuột khỏe mạnh, không có kháng thể tương ứng trong máu. Mỗi con tiêm 0.2 ml vắc xin vào dưới da.
- Lô ựối chứng: 10 chuột không tiêm vắc xin.
Sau 21 ngày tiến hành công cường ựộc với liều 10LD50, toàn bộ chuột ựược theo dõi 10 ngày. Phải có 70 - 90% số chuột lô thắ nghiệm ựược bảo hộ,
trong khi ựó lô dối chứng chuột chết 100% trong vòng 24- 48 giờ và ựều phân lập ựược vi khuẩn E.coli từ máu tim chuột chết.
* Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường ựộc trên bản ựộng vật:
Chọn 20 lợn khỏe mạnh, trọng lượng từ 10 -15 kg. Lợn ựược chia làm 4 lô bao gồm:
- 3 lô thắ nghiệm( lô 1, 2, 3): Tiêm phòng bảo hộ miễn dịch, mỗi lô 5 con, lợn ở mỗi lô ựược tiêm phòng vắc xin với liều 1 ml/con ( mỗi ml vắc xin chứa 4- 4.5 tỷ vi khuẩn).
- Lô ựối chứng (lô 4): Không tiêm phòng vắc xin.
Tất cả nuôi dưỡng chăm sóc sau 21 ngày tiến hành công cường ựộc, toàn bộ các lô ựược tiêm với liều 4x109 - 6x109 vi khuẩn. Theo dõi trong 10 ngày.
2.5.6 Phương pháp kiểm tra ựộ dài bảo quản vắc xin
Tiến hành kiểm vô trùng, an toàn và tra hiệu lực của vắc xin khi lưu kho ở các thời ựiểm 3, 6, 9, 10, 12 tháng sau khi sản xuất và bán ngoài thị trường.
(Căn cứ theo Ộhồ sơ ựăng ký sản xuất vắc xin E.coli phù ựầu lợnỢ tháng 3/2003)
2.5.7 Phương pháp kiểm tra ựộ dài miễn dịch của lợn sau khi ựã tiêm phòng vắc xin. vắc xin.
Sau khi tiến hành tiêm vắc xin phù ựầu cho lợn ựược 21 ngày, tiến hành lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể trong máu. Sau ựó ựịnh kỳ hàng tháng (1, 2, 3, 4, 5) tiến hành lấy máu lợn tại các trại ựã tiến hành tiêm vắc xin phù ựầu làm phản ứng kiểm tra hàm lượng kháng thể có trong máu.
(Căn cứ theo Ộhồ sơ ựăng ký sản xuất vắc xin E.coli phù ựầu lợnỢ tháng 3/2003)
2.5.8 Phương pháp ựếm vi khuẩn.
* Chuẩn bị:
- Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nước thịt.
- Nước muối sinh lý vô trùng ựược chắt vào các tube ựược ghi số từ 1- 9 với 0.9ml/1tube
- Thạch máu ựĩa, thạch MacConKey. * Tiến hành:
- Dùng Micropipet hút 0.1 ml canh trùng cho vào 1 tube nước sinh lý trộn ựều ta ựược nồng ựộ 10-1
- Trộn ựều, dùng micropipet hút 0.1 ml canh trùng từ ống 1 cho vào ống 2, ta ựược nồng ựộ 10-2, cứ làm như vậy khi nồng ựộ vi khuẩn là 10-9.