Bảng 3.7 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1
Nồng độ (µg/ml) % Ức chế 4a 4b ELLIPTICIN 100 71,87 73,43 85,29 20 61,96 62,05 78,30 4 46,67 47,85 38,79 0,8 21,81 31,57 9,09 IC50 5,69 4,94 0,53
Kết quả trên cho thấy mẫu 4a, 4b có hoạt tính khá mạnh trên dòng tế bào ung thư LU-1 với giá trị IC50 = 4,94 – 5,69 (µg/ml). Chất đối chứng dương Ellippithin hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99.
Bảng 3.8 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF7
Nồng độ (µg/ml) % Ức chế 4a 4b ELLIPTICIN 100 68,45 53,33 83,38 20 52,14 48,21 69,66 4 42,98 40,60 53,55 0,8 34,88 38,45 38,26 IC50 14,65 42,11 0,27
Kết quả trên cho thấy mẫu nghiên cứu 4a có hoạt tính khá mạnh trên dòng tế bào ung thư MCF7 với giá trị IC50 = 14,65 µg/ml. Mẫu 4b không thể hiện hoạt tính
tốt trên dòng MCF7. Chất đối chứng dương Ellipticin hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99.
3.5 Bàn luận
3.5.1 Về tổng hợp hóa học
Thông qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi rút ra các nhận xét sau.
3.5.1.1 Phản ứng đóng vòng tạo nhân 1H-benzo[d]imidazol
Phản ứng ngưng tụ giữa o-phenylendiamin với acid acetic sử dụng xúc tác HCl, tạo dẫn chất 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol với hiệu suất khá cao. Phản ứng xảy ra nhanh, theo các giai đoạn:
Sơ đồ 3.9 Phản ứng tổng hợp vòng 1H-benzo[d]imidazol
Hiệu suất phản ứng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố sau:
Nhiệt độ và thời gian phản ứng: Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 140-1450, thời gian là 45 phút, nếu nhiệt độ quá cao hiệu suất giảm do sự trùng hợp hóa và amin bị oxy hóa, nếu thời gian dài sẽ xuất hiện nhiều tạp, khó tinh chế.
Lượng HCl đặc dùng ít thì phản ứng xảy ra không hoàn toàn, dùng nhiều quá thì khi đó o-phenylendiamin không tồn tại ở trạng thái tự do, và do đó không phản ứng được với acid acetic.
3.5.1.2 Phản ứng thế ở vị trí N-1 trên nhân 1H-benzo[d]imidazol
Phản ứng tạo dẫn chất thế ở vị trí N-1 cho hiệu suất thấp, do chất ethyl cloroacetat là tác nhân alkyl hóa yếu, điều kiện phản ứng phải đảm bảo khan nước hoàn toàn, thời gian phản ứng tương đối dài (16 giờ).
Trong quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ mol giữa tác nhân thế và dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, khi tỉ lệ này <1,
phản ứng không xảy ra hoàn toàn dẫn đến giảm hiệu suất, khi tỉ lệ này >2 hiệu suất phản ứng cũng giảm, điều này có thể giải thích là do quá trình tạo muối amoni bậc 4 trên nhân 1H-benzo[d]imidazol.
Phản ứng sử dụng K2CO3 làm chất xúc tác với hai tác dụng, vừa là chất hoạt hóa dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol, vừa phản ứng với HCl sinh ra để tạo KHCO3, đảm bảo môi trường khan, không làm giảm hiệu suất phản ứng.
3.5.1.3 Phản ứng tạo hydrazid
Phản ứng xảy ra giữa ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat và hydrazin hydrat cho hiệu suất cao, dễ xử lý.
3.5.1.4 Phản ứng tạo vòng 1,3,4-oxadiazol
Phản ứng xảy ra theo cơ chế sau:
Sơ đồ 3.10Phản ứng tạo vòng 1,3,4-oxadiazol.
Trong phản ứng trên, tỷ mol tối ưu giữa carbondisulfid và dẫn chất hydrazid là 1:1, nếu lượng CS2 ít quá thì phản ứng xảy ra không hoàn toàn, hiệu suất giảm, nếu lượng CS2 nhiều thì quá trình tinh chế khó khăn hơn.
3.5.2 Về xác định cấu trúc của các hợp chất trung gian và sản phẩm 3.5.2.1 Phổ hồng ngoại 3.5.2.1 Phổ hồng ngoại
Phân tích phổ hồng ngoại cho phép thấy được các dải hấp thụ đặc trưng của dao động hóa trị, dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất được ghi phổ. Trên phổ IR của các chất được trình bày ở bảng 3.3 đều xuất hiện các dao động hóa trị đặc trưng cho các nhóm chức có trong công thức của các chất.
- Trên phổ IR của chất 3 có thấy xuất hiện các dải hấp thụ tương ứng với dao động hóa trị của nhóm -NH amid (3350, 3305 cm-1), đồng thời xuất hiện các dải hấp thụ 1660 cm-1 của nhóm –C=O, chứng tỏ trong công thức của chất 3 có nhóm hydrazid, như vậy phản ứng hydrazid hóa đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 4 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ 1321 cm-1 của nhóm C=S và dải hấp thụ 1146 cm-1 của nhóm C-O, đồng thời cũng xuất hiện dải hấp thụ 2600, 2500 cm-1 của nhóm S-H. Chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất 1,3,4- oxadiazol.
- Trên phổ IR của hợp chất 4b thấy xuất hiện dải hấp thụ 3303 cm-1 của nhóm –NH và dải hấp thụ 1655 của nhóm C=O amid, như vậy chứng tỏ đã xảy ra phản ứng alkyl hóa hợp chất 4 tạo dẫn chất thế 4b.
3.5.2.2 Phổ khối lượng
Phổ MS dùng để xác định khối lượng phân tử của các chất tổng hợp đuợc và số khối các mảnh ion bị phân mảnh từ công thức cấu tạo của các chất.
Kết quả phân tích phổ MS trong bảng 3.4đã cho thấy phổ khối lượng của từng chất đều cho các đỉnh cơ bản là các đỉnh có cường độ cao nhất có trị số m/z bằng khối lượng phân tử dự kiến của chất cần phân tích
3.5.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Dựa vào phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất. Phổ 1H-NMR xác định sự có mặt của các nhóm có proton dựa vào độ chuyển dịch hóa học, bộ khung của hợp chất (vòng thơm…), số lượng proton ở C bên cạnh căn cứ vào độ bội của tín hiệu cộng hưởng và sự có mặt của tạp chất (các tín hiệu lạ).
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR được trình bày trong bảng 3.5, kết quả cho thấy:
- Phổ 1H-NMR cho thấy số lượng proton, độ dịch chuyển, độ bội của tín hiệu là phù hợp với công thức thức cấu tạo của các chất như dự kiến.
Như vậy, từ các kết quả dữ liệu phổ IR, phổ MS, và phổ cộng hưởng từ proton, chúng tôi đã tổng hợp được các chất 3, 4, 4a, 4b như dự kiến.
3.5.3 Về tác dụng sinh học
3.5.3.1 Về tác dụng kháng khuẩn
Trong số 4 chất 3, 4, 4a, 4b thì chỉ có chất 4a là có tác dụng trên 4 chủng vi khuẩn: Sarcina lutea, Staphylococcusaureus,Proteus mirabilis, Shigellaflexneri.
Trong đó tác dụng trên các chủng vi khuẩn Gram(+) là tương đương với tác dụng trên các chủng Gram(-).
3.5.3.2 Về tác dụng kháng nấm
Các chất thử nghiệm đều không có tác dụng kháng nấm.
3.5.3.3 Về tác dụng gây độc tế bào
Chất 4a thể hiện hoạt tính khá mạnh trên dòng LU-1 (IC50= 5,69 μg/ml), hoạt tính yếu hơn trên dòng MCF7 (IC50= 14,65 μg/ml).
Chất 4b thể hiện hoạt tính hướng đích tốt trên dòng LU-1 trong khi không cho thấy hoạt tính trên dòng MCF7.
Như vậy, khi thay nhóm thế benzylclorid bằng nhóm thế -N-[4-(4 bromobutoxy)phenyl]acetamid thì tác dụng chống ung thư giảm nhiều trên dòng LU- 1, giảm nhẹ trên dòng MCF7. Ngoài ra, hợp chất 4a mà chúng tôi đã tổng hợp được có hoạt tính gây độc tế bào rất có triển vọng, cần được nghiên cứu nhiều hơn trong thời gian tới.