2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Hầu hết tuyến trùng ký sinh di động đƣợc phát hiện ở bên trong rễ thực vật và ở vùng đất xung quanh rễ. Vì thế thu các mẫu rễ và mẫu đất ở những cây kém phát triển và cây khỏe mạnh, có độ sâu từ 15-20 cm từ mặt đất.
Mỗi xã thu 3 ruộng đại diện, mỗi ruộng thu 3 điểm rồi trộn đất lại với nhau. Đất và rễ đƣợc giữ trong túi bóng và ký hiệu từng mẫu cụ thể để không bị nhầm lẫn giữa các ruộng. Sau đó mẫu sẽ để trong thùng mát vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tách. Mẫu đất và mẫu rễ chứa chung trong một túi.
Tổng số mẫu thu tại 3 vùng trồng lạc ở Hƣng Yên là 18 tổ hợp mẫu. Mỗi tổ hợp mẫu nhƣ vậy bao gồm cả đất, rễ, cây và quả lạc đại diện cho một địa điểm nghiên cứu. Mẫu vật sau khi đƣợc mang về phòng thí nghiệm thì tôi tiến hành làm mẫu đất trƣớc còn mẫu rễ đƣợc rửa sạch và bảo quản vào túi bóng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C-100C, nếu cao quá hoặc thấp quá có thể ảnh hƣởng không tốt đến tuyến trùng. Tránh tác động trực tiếp của tia nắng mặt trời.
2.2.2. Phương pháp tách tuyến trùng từ đất và mô thực vật
Tách tuyến trùng từ đất
Hầu hết các nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật đều có mặt trong đất. Việc tách tuyến trùng từ đất luôn bắt buộc, vì qua đó có thể biết đƣợc hầu hết các nhóm tuyến trùng ký sinh ở thực vật. Từ mỗi mẫu thu đƣợc, lấy trung bình 250g đất để tiến hành phân tích, kiểm tra mức độ gây hại và số lƣợng tuyến trùng ở đất. Thao tác tách tuyến trùng từ đất đƣợc áp dụng theo phƣơng pháp của N.N. Châu (2003) [1,2,3]. Quy trình tách lọc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
36
- Chuẩn bị mẫu đất: mẫu đất đƣợc trộn đều, định lƣợng 250g.
- Ngâm và hòa tan đất trong nƣớc: cho mẫu đất vào một xô nhựa có dung tích 5 lít. Đổ thêm 1 lít nƣớc vào, ngâm từ 30-60 phút tùy thuộc vào từng loại đất. Bóp vụn đất và khuấy đều, sau đó thêm 1,5-2 lít nƣớc, tiếp tục khuấy đều.
- Lọc thô loại bỏ cặn thô: dịch đất từ xô 1 đƣợc lọc qua rây lọc thô số 1 (đƣờng kính rây 20cm x chiều cao 5cm, kích thƣớc lỗ rây 0,5 µm) sang xô 2. Cặn trên rây đƣợc rửa lại bằng vòi nƣớc sạch, sau đó lọai bỏ cặn đất và rác bẩn còn lại trên rây.
- Gạn lọc: phần dung dịch đất có chứa tuyến trùng trong xô 2 tiếp tục đƣợc khuấy đều và gạn lọc từ xô 2 về xô 1 và tiếp tục nhƣ vậy 5-7 lần, tùy loại đất, cho đến khi loại bỏ hết cặn đất và cát nặng, chỉ còn lại dịch tuyến trùng ở dạng huyền phù.
- Lọc lấy tuyến trùng từ dịch huyền phù: tiến hành lọc 3 lần để thu hết số lƣợng tuyến trùng. Lọc lần 1: đổ dung dịch huyền phù từ xô 1 sang xô 2 qua một rây lọc tinh số 2 (đƣờng kính 20cm x chiều cao 5cm, kích thƣớc lỗ rây 75-80 µm), phần nƣớc đã lọc tinh lần 1 trong xô đƣợc giữ lại để lọc tinh lần 2. Phần cặn đất có tuyến trùng trên rây đƣợc rửa một cách cẩn thận cho đến khi sạch thì chuyển sang rây lọc tĩnh số 3 (đƣờng kính 80µm x chiều cao 1,5µm, kích thƣớc lƣới lọc 87-80 µm) bằng bình rửa. Tất cả nƣớc rửa tuyến trùng đều đƣợc hứng vào xô 1 để lọc lại. Lọc lần 2: dung dịch đất và nƣớc rửa lần 1 tiếp tục đƣợc lọc qua rây 2, rửa sạch cặn (tiếp tục giữ lại nƣớc rửa qua rây) chuyển tiếp cặn vào rây lọc tĩnh số 3. Lọc lần 3: nƣớc rửa lần 2 đƣợc lọc và rửa qua (lần này không thu hồi nƣớc rửa nên tốt nhất rửa ngƣợc từ dƣới đáy rây lên) rồi cẩn thận chuyển cặn thu đƣợc tiếp vào rây lọc số 3.
- Lọc tĩnh: rây lọc 3 đƣợc đặt sẵn vào đĩa petri (đƣờng kính 90 µm, cao 15 µm), sau khi thu nhận cặn tuyến trùng từ lần 3 lần lọc trên đây, điều chỉnh lƣợng nƣớc vừa ngập cặn trên rây, đậy nắp và đặt trên tĩnh 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống sẽ dễ dàng chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa petri.
- Thu hoạch tuyến trùng: nhấc rây ra khỏi đĩa petri, thu lại dịch nƣớc chứa tuyến trùng trong đĩa petri.
37
Tách tuyến trùng từ mô thực vật
Có nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh chuyên hóa ở các bộ phận khác nhau của thực vật nhƣ rễ, thân, lá, hoa và hạt. Đối với cây lạc thì chúng chủ yếu ký sinh ở rễ và vỏ củ lạc. Vì vậy để thu thập tuyến trùng cần phải tách chúng ra khỏi mô rễ và mô vỏ củ lạc. Cũng giống nhƣ tách tuyến trùng từ đất, có hàng loạt phƣơng pháp khác nhau để tách tuyến trùng từ mô thực vật. Ở đây tôi sử dụng phƣơng pháp lọc tĩnh để tách lọc tuyến trùng từ mẫu rễ và mẫu vỏ củ lạc [1,2,3].
Các bước của phương pháp lọc tĩnh (Theo N.N. Châu và N.V. Thanh, 1993) [2]: Đối với mẫu rễ: sau khi rửa sạch bằng vòi nƣớc hoa sen một cách cẩn thận thì rễ cắt nhỏ khoảng 2-5 cm, trộn đều, định lƣợng lấy 5gr. Sau đó thêm 250ml nƣớc sạch, cho vào máy nghiền với tốc độ 12.600 vòng trong 30 giây.
- Cho dung dịch đã đƣợc xay nhỏ lọc qua rây 40 µm để lọc lấy phần cặn rễ và gạn lọc lấy tuyến trùng ở dung dịch huyền phù còn lại. Sau đó tất cả đƣợc cho vào rây lọc tĩnh và đặt rây vào đĩa petri, thêm một lƣợng nƣớc sạch vừa đủ ngập phần rễ đã xay và đặt tĩnh ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sẽ từ rễ chui qua rây lọc xuống đĩa petri. Sau 48h nhấc rây lọc ra, thu phần nƣớc có tuyến trùng ở trong đĩa petri.
Đối với mẫu củ: sau khi đƣợc rửa sạch bằng nƣớc, vỏ củ lạc sẽ đƣợc tách riêng nhân hạt và đƣợc bẻ nhỏ khoảng từ 0,5-0,8 cm. Trộn đều rồi định lƣợng khối lƣợng vỏ củ là 10 gr, sau đó cho vào rây lọc tĩnh (kích thƣớc lỗ rây 85 µm).
- Đặt rây vào đĩa petri, thêm một lƣợng nƣớc sạch vừa đủ để ngập vỏ củ và đặt tĩnh ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sẽ từ mô vỏ chui qua rây lọc xuống đĩa petri. Sau 48h nhấc rây lọc ra, thu phần nƣớc có tuyến trùng ở trong đĩa petri.
2.2.3. Phương pháp cố định, xử lý tuyến trùng và làm tiêu bản
Cố định tuyến trùng
Cố định tuyến trùng: tuyến trùng kí sinh thực vật thu đƣợc từ các phƣơng pháp tách lọc nêu trên đƣợc đƣa vào dung dịch TAF để cố định và bảo quản (Courtney, Polley & Miller,1955) [2,3].
38
TAF: Formalin (40 %) 7ml Triethanolamine 2ml Nƣớc cất 91 ml
Tuyến trùng đƣợc cố định bằng TAF sẽ giữ đƣợc hình dạng kích thƣớc giống nhƣ thật. Trong dung dịch này, tuyến trùng giữ đƣợc sự ổn định trong một thời gian dài. Triethanolamine có khả năng trung hòa axit formic tự do và hút ẩm, bảo vệ mẫu không bị khô ngay cả trong trƣờng hợp dung dịch cố định bị bay hơi. Tuy nhiên, có hiện tƣợng thoái hóa cutin xảy ra sau vài năm, vì vậy nó không nên dùng đối với những mẫu cần bảo quản trong thời gian dài.
Xử lý tuyến trùng theo quy trình của Seinhorst (1959)
Trƣớc khi xử lý tuyến trùng cần chuẩn bị dung dịch I và dung dịch II nhƣ sau: Dung dịch I: Cồn 96 % 20ml
Glycerin 1ml Nƣớc cất 79ml Dung dịch II: Cồn 96 % 95ml Glycerin 5ml
Chuyển tuyến trùng từ dung dịch cố định sang chén nhuộm hoặc đĩa thủy tinh sâu có chứa 0,5 ml dung dịch I. Đặt chén hoặc đĩa này trong bình thủy tinh đậy kín có chứa khoảng 1/10 thể tích là cồn 96% và áp suất bão hòa. Đặt toàn bộ bình thủy tinh có các chén chứa tuyến trùng trong tủ ấm thời gian tối thiểu 12 giờ và nhiệt độ 400C. Ở trạng thái này hầu nhƣ toàn bộ nƣớc sẽ đƣợc bay hơi (cồn 20% sẽ hút cồn từ áp suất bão hòa và nƣớc sẽ đƣợc bay hơi và bị hút lại bởi cồn 96% trong bình hút ẩm) và làm cho tuyến trùng đƣợc ở trong khối lƣợng dung dịch cồn và glycerol lớn hơn khối lƣợng dung dịch I ban đầu.
Sau 12 giờ đặt trong bình hút ẩm chuyển các chén tuyến trùng ra khỏi bình và tiếp tục đặt trong tủ ấm để dung dịch bay hơi. Thời gian xử lý bay hơi trong tủ ẩm tốt nhất là 12 giờ, cứ mỗi 3 giờ bổ sung thêm vào chén một lƣợng dung dịch II cho gần đầy chén và đậy nắp chỉ để hở một phần cho phép sự bay hơi của cồn diễn ra từ từ, duy trì
39
tối thiểu 3-6 giờ tại nhiệt độ 400C. Sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong glycerol có thể sử dụng làm tiêu bản đƣợc.
Chuẩn bị tiêu bản tuyến trùng cho quan sát, định loại
Tuyến trùng sau khi đã xử lý hết nƣớc có thể đƣợc làm thành tiêu bản cố định trong dung dịch lactophenol hoặc glycerol. Nhƣng glycerol thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến nhất.
- Dùng ống đồng để khoanh các vòng paraphin lên lam kính. - Đặt một giọt nhỏ glycerol tinh khiết ở giữa vòng paraphin
- Gắp một số tuyến trùng (tốt nhất cùng loại) vào giọt glycerol. Số lƣợng tuyến trùng phụ thuộc vào kích thƣớc của tuyến trùng và yêu cầu quan sát, nhƣng thƣờng không vƣợt quá 10 tuyến trùng một tiêu bản. Sau khi gắp đủ lƣợng tuyến trùng đƣa lam lên kính hiển vi soi nổi để sắp xếp lại tuyến trùng sao cho tuyến trùng đƣợc xếp cùng chiều và không bị đè lên nhau.
- Đặt một vài mảnh sợi thủy tinh để đỡ tuyến trùng.
- Đậy lamen một cách cẩn thận, tốt nhất nghiêng lamen khoảng 450C và một đầu tiếp xúc trƣớc, hạ dần đầu kia sao cho khí không bị lẫn vào giọt glycerol.
- Đặt lam kính lên thanh nhiệt (650C trong vài phút) đƣợc đốt nhẹ bằng đèn cồn bên dƣới, paraphin sẽ chảy đều và gắn lamen.
Chú ý: lƣợng paraphin và glycerol sao cho vừa phải và phù hợp với kích thƣớc của tuyến trùng để paraphin không bị thừa và trào ra ngoài.
2.2.4. Phương pháp đếm và kỹ thuật gắp tuyến trùng
Đếm tuyến trùng
Tuyến trùng đƣợc đếm và tính số lƣợng bằng đĩa đếm tuyến trùng (counting dish) và đồng hồ đếm (counting machine) dƣới kính hiển vi soi nổi. Trong trƣờng hợp mẫu có ít tuyến trùng (<1000) có thể đổ cả tuyến trùng vào đĩa để đếm. Sau khi lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều, có thể đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa đếm hoặc có thể đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình 1 ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Trong trƣờng hợp mẫu có quá nhiều tuyến trùng thì
40
ta có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 50ml, sau đó lấy 10ml để đếm, lập lại lần 2 nhƣ vậy, tính trung bình số lƣợng tuyến trùng trên 10ml và nhân với 5.
Kỹ thuật gắp tuyến trùng
Đa số tuyến trùng có kích thƣớc rất nhỏ nên phải gắp tuyến trùng dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại thích hợp. Để có thể gắp đƣợc dễ dàng cần điều chỉnh lƣợng dung dịch tuyến trùng dƣới đĩa đếm ở mức vừa phải ( thƣờng 10ml cho đĩa đếm tiêu chuẩn của CHLB Đức) sao cho mức nƣớc trong đĩa không quá sâu cũng không nông quá. Đầu tiên dùng tay phải cầm kim gắp tuyến trùng đƣa mũi kim vào bên dƣới ở giữa cơ thể tuyến trùng đẩy nhẹ để tuyến trùng nổi lên bề mặt dung dịch, đồng thời tay trái điều chỉnh kính bám theo sự nổi lên của tuyến trùng, sau đó đƣa kim gắp từ phía dƣới vớt tuyến trùng cho vào dung dịch I trong chén đựng. Trƣớc khi gắp tuyến trùng tiếp theo nên kiểm tra đầu kim gắp xem tuyến trùng đã đƣợc chuyển vào chén hay vẫn còn dính ở đầu kim. Đối với một số loại tuyến trùng dạng xoắn thƣờng khó gắp hơn nên thƣờng phải đƣa chính xác đầu kim vào lỗ vòng tròn của tuyến trùng mới vớt lên đƣợc. Gió mạnh có thể làm cho bề mặt dung dịch chuyển động hoặc có thể làm bay mất tuyến trùng ở đầu kim nên cần che gió lại mới gắp tuyến trùng đƣợc.Đối với loại tuyến trùng hình tròn nhƣ con cái của tuyến trùng gây nốt sần không gắp đƣợc mà phải dùng pipet, panh siêu nhọn hoặc chổi lông nhỏ để gắp hoặc hút vớt chúng [1,2].
2.2.5. Phương pháp định loại tuyến trùng dựa vào hình thái
Công thức số đo tuyến trùng
Một trong những chỉ tiêu quan trọng dùng để phân loại tuyến trùng, đặc biệt phân loại đến loài là công thức số đo tuyến trùng. Công thức số đo tuyến trùng là hệ thống các chỉ số đo kích thƣớc các phần cơ thể và tỷ lệ tƣơng quan giữa các phần của chúng. Công thức số đo đƣợc áp dụng rộng rãi để phân loại và là phần bắt buộc khi mô tả một loài tuyến trùng. Có một số công thức số đo khác nhau đƣợc áp dụng trong đó công thức theo de Man (1880) với sự cải tiến bổ sung đƣợc áp dụng phổ biến nhất [4].
41
n = số lƣợng mẫu vật đo đƣợc.
L= tổng chiều dài cơ thể bằng µm hoặc mm.
a = chiều dài cơ thể ÷ chiều rộng lớn nhất (thƣờng là vị trí vulva).
b = chiều dài cơ thể ÷ chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột – thực quản. b’ = chiều dài cơ thể ÷ chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến tận cùng thực quản tuyến
c = chiều dài cơ thể ÷ chiều dài đuôi.
c’= chiều dài đuôi ÷ chiều rộng cơ thể tại hậu môn.
V = chiều dài cơ thể từ đỉnh đầu đến vulva x 100 ÷ chiều dài cơ thể. T= chiều dài từ huyệt đến đỉnh testis x 100 ÷ chiều dài cơ thể. st= chiều dài stylet bằng µm.
Một số chỉ số đôi khi được sử dụng cho một số nhóm tuyến trùng khác nhau:
a’= chiều dài cơ thể ÷ chiều rộng cơ thể không dính cutin (nhƣ ở Trichodorids hoặc gai cutin nhƣ ở Criconema spp.) (Mehta & Raski, 1971).
b1= chiều dài cơ thể (chiều dài từ đỉnh đầu đến gốc diều giữa).
G1= tổng chiều dài của nhánh sinh dục trƣớc từ vulva đến đỉnh buồng trứngtính qua cả phần gập (nếu có) x 100 ÷ chiều dài cơ thể.
G2= tổng chiều dài của nhánh sinh dục sau x 100 ÷ chiều dài cơ thể. H= chiều dài vùng sáng (hyaline) ở tận cùng đuôi.
M= chiều dài phần trƣớc của stylet (conus) x 100 ÷ tổng chiều dài stylet. O = chiều dài từ gốc stylet đến lỗ đổ của tuyến thực quản lƣng x 100 ÷
tổngchiều dài stylet
P = chiều dài từ phasmid đến hậu môn x 100 ÷ chiều dài đuôi (giá trị + hoặc là trƣớc hoặc sau hậu môn).
Pa = chiều dài từ đỉnh đầu đến phasmid trƣớc (trƣờng hợp lệch nhau) x 100 ÷ chiều dài cơ thể.
Pp = chiều dài từ đỉnh đầu đến phasmid sau x 100 ÷ chiều dài cơ thể. S = chiều dài stylet ÷ chiểu rộng cơ thể ở gốc stylet.
MB = chiều dài từ đỉnh đầu đến diều giữa x 100 ÷ tổng chiều dài thực quản.
Một số chỉ số được sử dụng cho họ Criconematidae (De Grisse, 1964):
R = số lƣợng vòng cơ thể. RB = chiều rộng một vòng cutin. Rst = số vòng từ đầu đến gốc stylet.
42
Roes = số vòng từ đầu đến gốc thực quản. Rex = số vòng từ đầu đến lỗ bài tiết.
RV = số vòng từ đầu đến vulva. Ran = số vòng đuôi.
RVan = số vòng từ vulva đến anus.
Phương pháp đo tuyến trùng
Tất cả các số đo đều đƣợc thực hiện qua kính hiển vi với độ phóng đại khác nhau. Để đo tuyến trùng có thể tiến hành theo 2 cách:
Đo trực tiếp bằng trắc vi thị kính: dùng một thị kính có lắp thƣớc đo để đo trực tiếp các cấu trúc của tuyến trùng. Để đo đƣợc các cấu trúc dài nhƣ chiều dài cơ thể tuyến trùng cần đo từng đoạn và dịch chuyển liên tiếp cho đến khi hết toàn bộ phần cần đo. Tuy vậy, phƣơng pháp này chỉ phù hợp để đo các phần nhỏ và có cấu trúc thẳng của tuyến trùng. Việc đo dịch chuyển từng đoạn sẽ bị sai số nhiều vì khó định vị các điểm nối trong các lần dịch chuyển.
Đo qua máy vẽ: để đo đƣợc trƣớc hết vẽ toàn bộ hoặc các phần cần đo qua máy vẽ đƣợc lắp vào kính hiển vi, sau đó tiến hành đo trên bản vẽ bằng một thƣớc phân đến µm bằng giấy hoặc vải có thể uốn cong theo hình dạng của tuyến trùng. Phƣơng pháp này đòi hỏi có mãy vẽ nhƣng cho phép đo cả chiều dài của tuyến trùng và có thể đo cả