Có 2 công bố quan trọng nhất về tuyến trùng ký sinh ở cây lạc tại Việt Nam. Nghiên cứu đầu tiên của Eroshenko & cs. (1985) [17] đã triển khai điều tra tuyến trùng ký sinh ở cây trồng trong đó có cây lạc ở các tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả điều tra đã xác định 25 loài tuyến trùng ký sinh tại 5 vùng trồng cây lạc ở các tỉnh Sơn La, Cao Bằng, Nam Định, Thái Binh và Nghệ An. Các loài tuyến trùng ký sinh phổ biến nhất là Macroposthonia magnifica, với mật độ ký sinh tới 100 cá thể trên một mẫu (500 gr đất gần rễ) gây lá vàng, một số nơi nhƣ Nam Định, Nghệ An mật độ tuyến trùng ký sinh từ 1.500-10.000 cá thể trong một mẫu đất có thể làm cây lạc chết từng đám. Ngoài loài trên đây một số loài tuyến trùng khác cũng khá phổ biến là
Tylenchorhynchus marshoodi, Pratylenchus coffeae với mật độ ký sinh lên đến hàng trăm cá thể trong mỗi mẫu.
Công trình nghiên cứu sau đó của Sharma & cs (1994), đã điều tra tuyến trùng ký sinh cây lạc ở 25 địa điểm thuộc 5 huyện của tỉnh Nghệ An đã xác định đƣợc 31 loài tuyến trùng ký sinh thuộc 25 giống. Trong đó, 3 nhóm loài ký sinh phổ biến hơn cả là
Macroposthonia ornata, Tylenchorhynchus annulatus và các loài Pratylenchus spp. Loài M. ornata đƣợc coi là quan trọng nhất vì có tỷ lệ nhiễm trong 93% mẫu đất khảo sát và chiếm ƣu thế trong 32% các địa điểm. Hiện tƣợng đỉnh rễ cây lạc bị sƣng có liên quan đến sự hiện diện của loài M. ornata. Loài Tylenchorhynchus annulatus có mặt trong 80% số mẫu nhƣng mật độ thƣờng thấp (dƣới 250 cá thể trên mẫu 500cm³ đất xung quanh rễ) . Các loài P. brachyurus và P. zeae khá đa dạng trong phân bố, trong đó P. brachyurus khá phổ biến trong đất cát ven biển trong khi loài P. zeae ƣa thích đất mùn ở vùng đồi núi trung du. Tuyến trùng bào nang giống Heterodera cũng đã đƣợc tìm thấy trong 43% các mẫu đất, nhƣng rễ cây lạc không có biểu hiện của u nang. Nhóm tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có 3 loài là M. graminicola, M. javanica
và Meloidogyne spp. đã đƣợc tìm thấy trong 77% các địa điểm khảo sát. Quần thể của các loài này đã bị nghi ngờ làm ảnh hƣởng đến sản xuất lúa thƣờng trồng luân canh
31
với cây lạc. Trong số tuyến trùng ở cây lạc Nghệ An có tới 21 loài đƣợc xác định lần đầu tiên trên cây lạc Việt Nam và 8 loài trong số này đã không đƣợc báo cáo trƣớc đây ở bất kỳ nƣớc nào.
Nhƣ vậy mặc dù mới có một số nghiên cứu ban đầu về tuyến trùng ký sinh ở cây lạc Việt Nam cũng đã cho thấy thành phần loài tuyến trùng ký sinh ở cây lạc tại một số vùng ở Việt Nam là khá phong phú và đa dạng.
1.2. Tình hình sản xuất cây lạc trong những năm gần đây ở tỉnh Hƣng Yên.
Vị trí địa lý và điều kiện thuận lợi cho sự phát triển cây lạc tại tỉnh Hưng Yên
Hƣng Yên là một tỉnh nằm ở trung tâm đồng bằng sông Hồng và đƣợc phân chia thành 10 đơn vị hành chính bao gồm thành phố Hƣng Yên và 9 huyện. Hƣng Yên, với đặc trƣng của một tỉnh đồng bằng, không có đồi, núi; địa hình tƣơng đối bằng phẳng. Đất nông nghiệp 61.037 ha, cây hàng năm 55.645 ha (chiếm 91%), còn lại là đất trồng cây lâu năm, mặt nƣớc nuôi trồng thủy sản, đất chuyên dùng và đất sử dụng cho các mục đích khác. Đất chƣa sử dụng khoảng 7.471ha, toàn bộ diện tích trên đều có khả năng khai thác và phát triển sản xuất nông nghiệp. Ngoài ra, Hƣng Yên còn là một tỉnh đƣợc bao bọc bởi sông Hồng và sông Luộc, nên có nguồn nƣớc ngọt rất dồi dào. Ngoài sông tự nhiên, Hƣng Yên còn có nhiều sông đào nhằm phục vụ yêu cầu của sản xuất nông nghiệp. Những con sông này thuộc hệ thống đại thuỷ nông Bắc Hƣng Hải. Sông Hồng có chứa lƣợng phù sa khá lớn và chính vùng đất Hƣng Yên cũng do dòng sông này bồi tụ nên. Các loại đất tuy khác nhau nhƣng đều do phù sa bồi tụ. Gần hai rìa sông là đất cát, cát pha tầng dày, rồi tiếp đến là cát pha tầng mỏng hoặc đất thịt nhẹ, đi sâu vào trong đồng là vùng đất sét có phủ một lớp đất thịt rất mỏng đƣợc gọi là vùng trong đê.
Đất trong đê là đất phù sa không đƣợc bồi, màu nâu tƣơi, trung tính, ít chua, không glây hoặc glây yếu. Vùng này chiếm tỉ lệ 32 % diện tích đất canh tác của tỉnh, tập trung nhiều nhất ở Yên Mỹ, Khoái Châu, Văn Giang , Kim Động, Văn Lâm, Tiên Lữ, Ân Thi, Mỹ Hào. Loại đất này có độ phì cao, giàu các chất đạm, lân, tƣơng đối
32
nhiều mùn, thích hợp với việc trồng lúa, các loại hoa màu và cây công nghiệp nhƣ mía, đay, dâu, lạc [45].
Chính vì vậy với những điều kiện thuận lợi trên nên cây lạc đã đƣợc trồng rất nhiều tại Hƣng Yên nhƣng có 3 vùng trọng điểm với diện tích trồng lạc lớn là: TP. Hƣng Yên, Kim Động, Khoái Châu. Vì thế, chúng tôi đã tập trung thu mẫu và nghiên cứu về tuyến trùng lạc tại 3 khu vực chính này.
Tình hình sản xuất cây lạc trong những năm gần đây ở tỉnh Hưng Yên
Theo số liệu báo cáo mới nhất của Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Hƣng Yên cho thấy diện tích trồng cây lạc tại các huyện trong tỉnh nhƣ sau:
Bảng 1.1. Diện tích trồng cây lạc ở tỉnh Hƣng Yên trong năm 2012, 2013
Đơn vị tính: ha Huyện, thành phố Tổng diện tích đất trồng Diện tích lạc Năm 2012 Diện tích lạc 2013 Mỹ Hào 35 Văn Lâm 197 26,3 24 Yên Mỹ 464 42,1 23 Khoái Châu 2.040 428,8 370 Văn Giang 1.076 3 5 Ân Thi 190 Kim Động 1.386 105 108 Tiên Lữ 815 28,3 40 Phù Cừ 630 TP. Hƣng Yên 567 123,81 130 Cộng 7.400 757,31 700 Qua bảng trên ta có thể thấy diện tích trồng cây lạc trong những năm gần đây có sự giảm đi đáng kể, cụ thể năm 2012 diện tích trồng cây lạc chiếm khoảng 10,2% so với tổng diện tích đất trồng, còn năm 2013 là 9,5%. Nguyên nhân gây giảm diện tích trồng cây lạc trong những năm gần đây là do xuất hiện một số dịch bệnh mới làm
33
giảm năng suất cây lạc. Đồng thời ở một số huyện trọng điểm trồng cây lạc trong tỉnh có xu hƣớng chuyển đổi cây trồng sang cây có giá trị kinh tế cao hơn. Cụ thể ở T.P Hƣng Yên chuyển sang trồng cây ăn quả lâu năm, còn Huyện Kim Động chuyển sau trồng cây rau màu. Riêng có Huyện Khoái Châu nhờ phƣơng pháp trồng xen canh cây lạc với một số loại cây khác nhƣ ngô, chuối, nghệ thì diện tích trồng cây lạc lại tăng lên so với các năm trƣớc. Nhƣng nhìn chung diện tích trồng cây lạc trong tỉnh vẫn giảm so với các năm trƣớc. Nhìn vào bảng trên nhận thấy chỉ có 3 huyện là trồng nhiều cây lạc nhất gồm: Khoái Châu, Kim Động và T.P Hƣng Yên. Cụ thể số liệu về diện tích trồng cây lạc nhiều nhất ở các x trong từng huyện trên nhƣ sau:
Bảng 1.2. Diện tích trồng cây lạc nhiều nhất ở các xã tại 3 khu vực Khoái Châu, Kim Động, T.P Hƣng Yên trong năm 2013
Huyện, Thành phố Xã Diện tích (ha)
H. Khoái Châu Chí Tân 214 Ông Đình 220 H. Kim Động Hiệp Cƣờng 80 Chính Nghĩa 12 TP. Hƣng Yên An Tảo 20 Bảo Khê 51
Căn cứ vào số liệu trên, tôi đã tập trung thu mẫu đại diện ở 6 xã Chí Tân, Ông Đình (Khoái Châu), Hiệp Cƣờng, Chính Nghĩa (Kim Động), An Tảo, Bảo Khê (TP.Hƣng Yên) với diện tích trồng cây lạc nhiều nhất trong tỉnh.
34
Chƣơng 2 - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: tiến hành điều tra, thu mẫu tại một số vùng trồng cây lạc chính ở tỉnh Hƣng Yên. Cụ thể, tại huyện Khoái Châu gồm các xã chính: Chí Tân và Ông Đình. Huyện Kim Động: Chính Nghĩa và Hiệp Cƣờng. TP. Hƣng Yên: Bảo Khê và An Tảo.
Hình 2.1. Sơ đồ thu mẫu
Thời gian: đợt khảo sát thu mẫu tuyến trùng ký sinh trên cây lạc ở tỉnh Hƣng Yên đƣợc triển khai vào tháng 03/2013 và thời gian nghiên cứu mẫu tại phòng thí nghiệm từ tháng 03/2013 đến 09/2013 tại Phòng Tuyến trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Dụng cụ: xô nhựa, túi bóng, rây lọc với các kích thƣớc lỗ rây từ 5 µm tới 40 µm, đĩa petri, giấy lọc, kính lúp, kính hiển vi soi nổi OLUMPUS SZ10, kính hiển vi quang
35
học OLYMPUS BX51 gắn máy ảnh, tủ định ôn, đĩa đếm, cốc thủy tinh, pipetman, kim gắp, lamen, lam kính, máy xay, cân tiểu ly, kéo, bút…
Vật liệu: cồn tuyệt đối, glycerin, formalin (40%),triethanolamine, nƣớc cất.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Hầu hết tuyến trùng ký sinh di động đƣợc phát hiện ở bên trong rễ thực vật và ở vùng đất xung quanh rễ. Vì thế thu các mẫu rễ và mẫu đất ở những cây kém phát triển và cây khỏe mạnh, có độ sâu từ 15-20 cm từ mặt đất.
Mỗi xã thu 3 ruộng đại diện, mỗi ruộng thu 3 điểm rồi trộn đất lại với nhau. Đất và rễ đƣợc giữ trong túi bóng và ký hiệu từng mẫu cụ thể để không bị nhầm lẫn giữa các ruộng. Sau đó mẫu sẽ để trong thùng mát vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tách. Mẫu đất và mẫu rễ chứa chung trong một túi.
Tổng số mẫu thu tại 3 vùng trồng lạc ở Hƣng Yên là 18 tổ hợp mẫu. Mỗi tổ hợp mẫu nhƣ vậy bao gồm cả đất, rễ, cây và quả lạc đại diện cho một địa điểm nghiên cứu. Mẫu vật sau khi đƣợc mang về phòng thí nghiệm thì tôi tiến hành làm mẫu đất trƣớc còn mẫu rễ đƣợc rửa sạch và bảo quản vào túi bóng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C-100C, nếu cao quá hoặc thấp quá có thể ảnh hƣởng không tốt đến tuyến trùng. Tránh tác động trực tiếp của tia nắng mặt trời.
2.2.2. Phương pháp tách tuyến trùng từ đất và mô thực vật
Tách tuyến trùng từ đất
Hầu hết các nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật đều có mặt trong đất. Việc tách tuyến trùng từ đất luôn bắt buộc, vì qua đó có thể biết đƣợc hầu hết các nhóm tuyến trùng ký sinh ở thực vật. Từ mỗi mẫu thu đƣợc, lấy trung bình 250g đất để tiến hành phân tích, kiểm tra mức độ gây hại và số lƣợng tuyến trùng ở đất. Thao tác tách tuyến trùng từ đất đƣợc áp dụng theo phƣơng pháp của N.N. Châu (2003) [1,2,3]. Quy trình tách lọc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
36
- Chuẩn bị mẫu đất: mẫu đất đƣợc trộn đều, định lƣợng 250g.
- Ngâm và hòa tan đất trong nƣớc: cho mẫu đất vào một xô nhựa có dung tích 5 lít. Đổ thêm 1 lít nƣớc vào, ngâm từ 30-60 phút tùy thuộc vào từng loại đất. Bóp vụn đất và khuấy đều, sau đó thêm 1,5-2 lít nƣớc, tiếp tục khuấy đều.
- Lọc thô loại bỏ cặn thô: dịch đất từ xô 1 đƣợc lọc qua rây lọc thô số 1 (đƣờng kính rây 20cm x chiều cao 5cm, kích thƣớc lỗ rây 0,5 µm) sang xô 2. Cặn trên rây đƣợc rửa lại bằng vòi nƣớc sạch, sau đó lọai bỏ cặn đất và rác bẩn còn lại trên rây.
- Gạn lọc: phần dung dịch đất có chứa tuyến trùng trong xô 2 tiếp tục đƣợc khuấy đều và gạn lọc từ xô 2 về xô 1 và tiếp tục nhƣ vậy 5-7 lần, tùy loại đất, cho đến khi loại bỏ hết cặn đất và cát nặng, chỉ còn lại dịch tuyến trùng ở dạng huyền phù.
- Lọc lấy tuyến trùng từ dịch huyền phù: tiến hành lọc 3 lần để thu hết số lƣợng tuyến trùng. Lọc lần 1: đổ dung dịch huyền phù từ xô 1 sang xô 2 qua một rây lọc tinh số 2 (đƣờng kính 20cm x chiều cao 5cm, kích thƣớc lỗ rây 75-80 µm), phần nƣớc đã lọc tinh lần 1 trong xô đƣợc giữ lại để lọc tinh lần 2. Phần cặn đất có tuyến trùng trên rây đƣợc rửa một cách cẩn thận cho đến khi sạch thì chuyển sang rây lọc tĩnh số 3 (đƣờng kính 80µm x chiều cao 1,5µm, kích thƣớc lƣới lọc 87-80 µm) bằng bình rửa. Tất cả nƣớc rửa tuyến trùng đều đƣợc hứng vào xô 1 để lọc lại. Lọc lần 2: dung dịch đất và nƣớc rửa lần 1 tiếp tục đƣợc lọc qua rây 2, rửa sạch cặn (tiếp tục giữ lại nƣớc rửa qua rây) chuyển tiếp cặn vào rây lọc tĩnh số 3. Lọc lần 3: nƣớc rửa lần 2 đƣợc lọc và rửa qua (lần này không thu hồi nƣớc rửa nên tốt nhất rửa ngƣợc từ dƣới đáy rây lên) rồi cẩn thận chuyển cặn thu đƣợc tiếp vào rây lọc số 3.
- Lọc tĩnh: rây lọc 3 đƣợc đặt sẵn vào đĩa petri (đƣờng kính 90 µm, cao 15 µm), sau khi thu nhận cặn tuyến trùng từ lần 3 lần lọc trên đây, điều chỉnh lƣợng nƣớc vừa ngập cặn trên rây, đậy nắp và đặt trên tĩnh 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống sẽ dễ dàng chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa petri.
- Thu hoạch tuyến trùng: nhấc rây ra khỏi đĩa petri, thu lại dịch nƣớc chứa tuyến trùng trong đĩa petri.
37
Tách tuyến trùng từ mô thực vật
Có nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh chuyên hóa ở các bộ phận khác nhau của thực vật nhƣ rễ, thân, lá, hoa và hạt. Đối với cây lạc thì chúng chủ yếu ký sinh ở rễ và vỏ củ lạc. Vì vậy để thu thập tuyến trùng cần phải tách chúng ra khỏi mô rễ và mô vỏ củ lạc. Cũng giống nhƣ tách tuyến trùng từ đất, có hàng loạt phƣơng pháp khác nhau để tách tuyến trùng từ mô thực vật. Ở đây tôi sử dụng phƣơng pháp lọc tĩnh để tách lọc tuyến trùng từ mẫu rễ và mẫu vỏ củ lạc [1,2,3].
Các bước của phương pháp lọc tĩnh (Theo N.N. Châu và N.V. Thanh, 1993) [2]: Đối với mẫu rễ: sau khi rửa sạch bằng vòi nƣớc hoa sen một cách cẩn thận thì rễ cắt nhỏ khoảng 2-5 cm, trộn đều, định lƣợng lấy 5gr. Sau đó thêm 250ml nƣớc sạch, cho vào máy nghiền với tốc độ 12.600 vòng trong 30 giây.
- Cho dung dịch đã đƣợc xay nhỏ lọc qua rây 40 µm để lọc lấy phần cặn rễ và gạn lọc lấy tuyến trùng ở dung dịch huyền phù còn lại. Sau đó tất cả đƣợc cho vào rây lọc tĩnh và đặt rây vào đĩa petri, thêm một lƣợng nƣớc sạch vừa đủ ngập phần rễ đã xay và đặt tĩnh ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sẽ từ rễ chui qua rây lọc xuống đĩa petri. Sau 48h nhấc rây lọc ra, thu phần nƣớc có tuyến trùng ở trong đĩa petri.
Đối với mẫu củ: sau khi đƣợc rửa sạch bằng nƣớc, vỏ củ lạc sẽ đƣợc tách riêng nhân hạt và đƣợc bẻ nhỏ khoảng từ 0,5-0,8 cm. Trộn đều rồi định lƣợng khối lƣợng vỏ củ là 10 gr, sau đó cho vào rây lọc tĩnh (kích thƣớc lỗ rây 85 µm).
- Đặt rây vào đĩa petri, thêm một lƣợng nƣớc sạch vừa đủ để ngập vỏ củ và đặt tĩnh ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sẽ từ mô vỏ chui qua rây lọc xuống đĩa petri. Sau 48h nhấc rây lọc ra, thu phần nƣớc có tuyến trùng ở trong đĩa petri.
2.2.3. Phương pháp cố định, xử lý tuyến trùng và làm tiêu bản
Cố định tuyến trùng
Cố định tuyến trùng: tuyến trùng kí sinh thực vật thu đƣợc từ các phƣơng pháp tách lọc nêu trên đƣợc đƣa vào dung dịch TAF để cố định và bảo quản (Courtney, Polley & Miller,1955) [2,3].
38
TAF: Formalin (40 %) 7ml Triethanolamine 2ml Nƣớc cất 91 ml
Tuyến trùng đƣợc cố định bằng TAF sẽ giữ đƣợc hình dạng kích thƣớc giống nhƣ thật. Trong dung dịch này, tuyến trùng giữ đƣợc sự ổn định trong một thời gian dài. Triethanolamine có khả năng trung hòa axit formic tự do và hút ẩm, bảo vệ mẫu không bị khô ngay cả trong trƣờng hợp dung dịch cố định bị bay hơi. Tuy nhiên, có hiện tƣợng thoái hóa cutin xảy ra sau vài năm, vì vậy nó không nên dùng đối với những mẫu cần bảo quản trong thời gian dài.
Xử lý tuyến trùng theo quy trình của Seinhorst (1959)
Trƣớc khi xử lý tuyến trùng cần chuẩn bị dung dịch I và dung dịch II nhƣ sau: Dung dịch I: Cồn 96 % 20ml
Glycerin 1ml