KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2.1. Thu thập, phân lập và giám ựịnh các chủng nấm ký sinh trên sâu hạ
- Nghiên cứu diễn biến về tỷ lệ nấm ký sinh tự nhiên trên ựồng ruộng: Trong năm 2010, cùng với ựiều tra diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị rệp sáp hại, chúng tôi tiến hành ựiều tra về tỷ lệ rệp sáp bị nấm ký sinh trên ựồng ruộng,
kết quả ựiều tra trên ựồng ruộng chúng tôi nhóm chung các loài nấm và tắnh tỷ lệ chung, vì trên ựồng ruộng không thể phân biệt ựược các loài nấm ký sinh ngaỵ Kết quả ựiều tra chúng tôi trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tỷ lệ cành cà phê bị nhiễm rệp sáp và tỷ lệ rệp sáp xanh mềm bị nấm ký sinh trên trên ựồng ruộng tại Buôn Ma Thuột năm 2010
Vườn kiết thiết cơ bản Vườn kinh doanh Ngày ựiều tra Tỷ lệ cành cà phê nhiễm rệp mềm xanh (%) Tỷ lệ rệp sáp xanh mềm bị nấm ký sinh tự nhiên (%) Tỷ lệ cành cà phê nhiễm rệp mềm xanh (%) Tỷ lệ rệp sáp xanh mềm bị nấm ký sinh tự nhiên (%) 19/1/2010 42,22 16,47 0,13 6,07 2/2/2010 63,33 15,56 3,33 17,21 3/3/2010 62,22 13,7 6,66 14,33 16/3/2010 78,89 26,47 13,3 24,53 30/3/2010 64,44 22,89 13,3 21,67 13/4/2010 50,07 36,53 6,66 38,56 27/4/2010 42,22 53,68 3,33 55,70 11/5/2010 32,22 55,12 0,17 44,27 25/5/2010 22,22 45,13 1,11 43,47 8/6/2010 17,78 47,34 1,11 48,22 22/6/2010 21,11 41,94 3,33 44,13 6/7/2010 34,44 36,33 6,66 35,37 20/7/2010 47,78 40,31 1,11 41,47 3/8/2010 68,89 52,43 3,33 50,91 17/8/2010 67,78 50,34 6,66 48,94 31/8/2010 57,78 67,22 13,3 64,72 14/9/2010 51,11 57,32 20,3 55,47 28/9/2010 63,33 44,65 13,3 47,12 12/10/2010 55,56 48,93 6,66 49,96 26/10/2010 51,11 25,68 3,33 26,24 9/11/2010 48,89 23,67 1,11 24,17
Kết quả ựiều tra cho thấy: Nhìn chung tỷ lệ nấm ký sinh trên rệp sáp mềm xanh ngoài ựồng ruộng rất cao, có những quần thể rệp bị nhiễm nấm 100%. Diễn biến của nấm ký sinh trong năm trên ựồng ruộng cũng khác nhau, chúng phụ thuộc nhiều vào ẩm ựộ, ựặc biệt qua ựiều tra theo dõi sau những cơn mưa kéo dài ngày thì tỷ lệ nấm tăng ựột biến. Trong ựiều kiên thời tiết từ tháng 1 ựến tháng 3, tỷ lệ nấm ký sinh trên ựồng ruộng có thấp hơn, sau ựó từ tháng 4 tỷ lệ này tăng lên, tuy nhiên có những ựợt giảm xuống do thời tiết nhiều ngày không mưạ Tỷ lệ rệp bị nấm ký sinh ựạt cao nhất ngoài tự nhiên là 67,22 vào cuối tháng 8. điều này cho thấy nấm ký sinh ựóng vai trò rất lớn trong việc hạn chế số lượng trong quần thể rệp sáp.
Hình 3.7. Rệp sáp mềm xanh bị nấm ký sinh trên ựồng ruộng tại đắk Lắk, năm 2009
- điều tra thu thập nguồn rệp sáp bị nấm ký sinh tại các vùng trồng nhiều cà phê bao gồm các huyện: Krông Păk, CưKuin, CưMga, Buôn Hồ và TP. Buôn Ma Thuột Ờ đắk Lắk, huyện đắk Mil Ờ đắk Nông, huyện Chư Sê Ờ Gia Laị Ngoài ra chúng tôi có ựiều tra thu thập bổ sung nguồn từ các vùng trồng cà phê khác như huyện Nghĩa đàn và thị xã Thái Hòa Ờ Nghệ An,
huyện Thuận Châu và TP. Sơn La Ờ Sơn La và một số nguồn trên các ký chủ khác ở các vùng khác nhaụ Kết quả thu thập ựược với số lượng mẫu rất phong phú, sau khi lựa chọn các mẫu ựiển hình ựể ựem về phòng thắ nghiệm tiến hành phân lập, và giám ựịnh loài bằng phương pháp hình thái học kết hợp với phân tắch DNẠ Kết quả phân lập và giám ựịnh như sau:
+ Giám ựịnh bằng hình thái: Sau khi nuôi cấy các chủng nấm trên môi trường N1 sau 5 ngày, tiến hành lấy các mẫu cành bào tử ựể soi trên kắnh hiển vi ựể giám ựịnh loàị Kết quả mô tả hình thái một số chủng như sau:
Chủng MR1:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Xanh rêu kèm ánh vàng, gần giống màu mai cua, dạng bông xốp, khi già màu trở nên ựậm hơn. Trên bề mặt xuất hiện những ựám sợi khắ sinh màu trắng.
Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu nâu nhạt.
Tốc ựộ mọc: Mọc nhanh, ựạt kắch thước 4-5cm sau 4-5 ngày nuôi cấy, sau ựó lan kắn hộp Peptrị Tạo những rãnh ựồng tâm với sự hình thành các ựám bào tử và các sợi khắ sinh xen kẽ.
- Cơ quan sinh bào tử: Cuống sinh bào tử: không màu, phân nhánh dị thường, tạo thành các cụm cuống sinh bào tử dày ựặc. Kắch thước ựạt tới 200 x 3,5-4 ộm, các tế bào sinh bào tử dạng chai, kắch thước 2-2,5 x 8-12 ộm.
Bào tử dạng phialo, tạo thành lên thành lớp dày ựặc, hình , kắch thước 3-3,5ộm.
đây là hình dạng ựiển hình của loài nấm Metarhizium anisopliae
Chủng MR2 Ờ MR9:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Xanh rêu ựậm, khi già màu trở nên ựậm hơn. Trên bề mặt xuất hiện những ựám sợi khắ sinh màu trắng.
Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu ựậm hơn.
Tốc ựộ mọc: Mọc nhanh, ựạt kắch thước 3-3,5 cm sau 4-5 ngày nuôi cấỵ Tạo những rãnh ựồng tâm với sự hình thành các ựám bào tử và các sợi khắ sinh xen kẽ.
- Cơ quan sinh bào tử: Cuống sinh bào tử: không màu, phân nhánh dị thường, tạo thành các cụm cuống sinh bào tử dày ựặc. Kắch thước ựạt tới 200 x 3,5-4 ộm, các tế bào sinh bào tử dạng chai, kắch thước 2-2,5 x 8-12ộm.
Bào tử dạng phialo, tạo thành lên thành lớp dày ựặc, hình , kắch thước 3-3,5ộm.
đây là hình dạng ựiển hình của loài Metarhizium anisopliae Chủng BR1, BR2:
Mô tả: Về hình dạng khuẩn lạc và cơ quan sinh bào tử hai chủng BR1 và BR2 có những ựặc ựiểm phân loại giống nhau hoàn toàn như sau:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Khuẩn lạc màu trắng hoàn toàn, dạng bông xốp. Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu ựậm hơn.
Tốc ựộ mọc: Mọc nhanh, ựạt kắch thước 3-3,5 cm sau 4-5 ngày nuôi cấỵ Tạo những rãnh ựồng tâm.
- Cơ quan sinh bào tử: Cuống sinh bào tử sinh ra từ sợi khắ sinh với các ựặc ựiểm: ngắn, phần cuống phình to, phần ngọn thót lại, từ ựó sinh ra các bào tử nhỏ hình cầu ựến hình elip, kắch thước 2,5-3,5ộm.
đây là hình dạng ựiển hình của loài Beauveria bassiana Chủng BR3-BR6, BR8 Ờ BR11, BR13 Ờ BR14:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Khuẩn lạc màu trắng hoàn toàn, dạng bông xốp. Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu ựậm hơn.
Tốc ựộ mọc: Mọc nhanh, ựạt kắch thước 3-3,5 cm sau 4-5 ngày nuôi cấỵ Tạo những rãnh ựồng tâm.
- Cơ quan sinh bào tử: Trên môi trường nuôi cấy, các ựám bào tử hình quả bóng ựược sinh ra dày ựặc, trên ựó hình thành các cụm cuống sinh bào tử ngắn, phần cuống phình to, phần ngọn thót lại, từ ựó sinh ra các bào tử nhỏ hình cầu ựến hình elip, kắch thước 2,5-3,5ộm.
đây là hình dạng ựiển hình của loài Beauveria bassiana
Một số hình ảnh về rệp sáp bị nhiễm nấm ký sinh Hình 3.8. Rệp sáp bột tua ngắn bị nấm Metarhizium ký sinh Hình 3.9. Rệp sáp bột tua ngắn bị nấm Beauveria ký sinh Hình 3.10. Rệp sáp mềm xanh bị nấm ký sinh Hình 3.11. Rệp sáp bột 2 tua dài bị nấm Metarhizium ký sinh
Một số hình ảnh về khuẩn lạc và cành bào tử các chủng nấm
Hình 3.12. Khuẩn lạc chủng MR1 Hình 3.13. Cuống sinh bào tử chủng MR1
Hình 3.14. Khuẩn lạc chủng MR4 Hình 3.15. Bào tử chủng MR4
Hình 3.16. Khuẩn lạc chủng BR5 Hình 3.17. Cành bào tử của chủng BR5
Trong số 25 chủng nấm ký sinh trên rệp sáp cà phê ựã phân lập, chúng tôi nhận thấy có 8 chủng với ựặc ựiểm hình thái về khuẩn lạc, cành bào tử và bào tử khó giám ựịnh ựược ựến loài, nên chúng tôi sử dụng công nghệ ựọc trình tự DNA và so sánh với ngân hàng genẹ Các chủng và mồi sử dụng trong nghiên cứu và kết quả nghiên cứu sau khi giải mã trình tự gene từng chủng, so sánh ựộ tương ựồng với các trình tự tham chiếu ựược trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả ựịnh tên các mẫu nấm ký sinh bằng phương pháp giải trình tự gene (giám ựịnh tại đH Missouri Ờ USA, 2011)
TT Mẫu Trình tự Mồi Loài gần nhất
Trình tự tham chiếu
độ tương ựồng
1 BR2 VT589 ITS1 Beauveria bassiana GQ249879 527/527 (100%)
2 BR5 VT590 ITS4 Beauveria bassiana GQ249879 512/513
(99,8%)
3 BR12 VT591 ITS1 Cephalosporium
lanoso-niveum AJ292396 518/519
(99,8%)
4 BR7 VT592 ITS4 Cordyceps nutans AF224274 541/541 (100%)
5 BR15 VT629-
VT630 ITS1 Toxicocladosporium sp. EU040243
243/255 (95,3%) (95,3%) 6 MR4 VT631-VT632 ITS4 Metarhizium anisopliae FJ545308 552/552 (100%) 7 MR7 VT633-VT634 ITS1 Metarhizium anisopliae AF134150 474/475 (99,8%)
8 BR16 VT635-
VT636 ITS4 Paecilomyces cicadae AB085888
543/543 (100%) (100%)
Thông qua kết quả giải trình tự gen, mẫu BR2 sau khi giải trình tự và so sánh với ngân hàng genbank có ựộ tương ựồng 527/527 cặp nucleotide (ựạt 100%) với loài Beauveria bassiana; mẫu BR5 có ựộ tương ựồng 512/513 cặp nucleotide (ựạt 99.8%) là loài Beauveria bassiana; mẫu BR12 là loài
Cephalosporium lanoso-niverum, ựộ tương ựồng 518/519 cặp nucleotide (ựạt 99.8%); mẫu BR7 có ựộ tương ựồng 541/541 cặp nucleotide với loài Cordyceps nutans (ựạt 100%); Toxicocladosporium sp. là loài gần nhất với mẫu BR15 (ựộ tương ựồng ựạt 95.3%, 243/255 cặp nucleotide); mẫu MR4, MR7 tương ựồng
100% và 99.8 % với loài Metarhizium anisopliae; mẫu BR16 tương ựồng 100% với loài Paecilomyces cicadae (ựạt 543/543 cặp nucleotide).
Qua kết quả giám ựịnh các chủng nấm, chúng tôi thu ựược thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê ựược trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê (Viện BVTV, 2009 Ờ 2011) TT Loài nấm Ký hiệu chủng Ký chủ (họ ký chủ) địa ựiểm thu MR1 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk MR2 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk MR3 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La MR4 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk MR6 Rệp sáp mềm (Coccidae) Nghệ An MR7 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk MR8 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Gia Lai 1 Metarhizium
anisopliae
MR9 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Gia Lai BR1 Rệp sáp mềm (Coccidae) Sơn La BR2 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk BR3 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An BR4 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An BR5 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk BR6 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An BR8 Rệp sáp mềm (Coccidae) đắk Lắk BR9 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk BR11 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Hà Nội 2 Beauveria bassiana BR14 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La 3 Cephalosporium lanoso-niveum BR12 Rệp sáp mềm (Coccidae) đắk Lắk 4 Cordyceps nutans BR7 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk
Kết quả ựã thu thập ựược 4 loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê, trong ựó loài Metarhizium anisopliae thu ựược 8 chủng, loài Beauveria bassiana thu ựược 10 chủng, loài Cephalosporium lanoso-niveum thu ựược 1
chủng và loài Cordyceps nutans thu ựược 1 chủng. Như vậy, 2 loài nấm
M. anisopliae và B. bassiana là những loài có tần suất ký sinh gây bệnh trên rệp sáp caọ đây là kết quả lần ựầu tiên xác ựịnh về thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê tại Việt Nam.
Cùng với kết kết quả thu thập, phân lập và giám ựịnh các mẫu vật thuộc các loài sâu hại khác ựược thu thập bổ sung ở các vùng khác nhau ựến năm 2011 ựược trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Danh sách các chủng nấm ký sinh trên sâu hại ựã phân lập ựược ở Việt Nam 2009 - 2011
TT Ký hiệu chủng Loài nấm Ký chủ (họ ký chủ) địa ựiểm 1 MR1 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk 2 MR2 Metarhizium anisopliae Rệp sáp (Pseudococcidae) đắk Lắk 3 MR3 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La 4 MR4 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk 5 MR5 Metarhizium anisopliae Rầy nâu
(Delphasidae) Hà Nội 6 MR6 Metarhizium anisopliae Rệp sáp mềm xanh
(Coccidae) Nghệ An 7 MR7 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột
(Pseudococcidae) đắk Lắk 8 MR8 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột
(Pseudococcidae) Gia Lai 9 MR9 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột
(Pseudococcidae) Gia Lai 10 BR1 Beauveria bassiana Rệp sáp mềm xanh
(Coccidae) Sơn La 11 BR2 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk 12 BR3 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An 13 BR4 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An
TT Ký hiệu chủng Loài nấm Ký chủ (họ ký chủ) địa ựiểm 14 BR5 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk 15 BR6 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An 16 BR7 Cordyceps nutans Rệp sáp bột (Pseudococcidae) đắk Lắk 17 BR8 Beauveria bassiana Rệp sáp mềm xanh
(Coccidae) đắk Lắk 18 BR9 Beauveria bassiana Rệp sáp bột
(Pseudococcidae) đắk Lắk 19 BR10 Beauveria bassiana Sâu róm thông
(Lymatridae) Nghệ An 20 BR11 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Hà Nội 21 BR12 Cephalosporium lanoso- niveum Rệp sáp mềm xanh (Coccidae) đắk Lắk 22 BR13 Beauveria bassiana Sâu ựo vải
(Geometridae)
Bắc Giang 23 BR14 Beauveria bassiana Rệp sáp bột
(Pseudococcidae) Sơn La 24 BR15 Toxicocladosporium sp. Rầy nâu
(Delphasidae) Hà Nội 25 BR16 Paecilomyces cicadae Ve sầu (Cicadidae) đắk Lắk
Kết quả ựã thu thập ựược 25 chủng thuộc 6 loài nấm ký sinh, bao gồm 9 chủng thuộc loài nấm Metarhizium anisopliae trong ựó 4 chủng thu ựược ở đắk Lắk, 2 chủng ở Gia Lai, 1 chủng ở Sơn La, 1 chủng ở Nghệ An và 1 chủng ở Hà Nội; 12 chủng thuộc loài Beauveria bassiana trong ựó 4 chủng thu ựược ở đắk Lắk, 4 chủng ở Nghệ An, 2 chủng ở Sơn La, 1 chủng ở Hà Nội và 1 chủng ở Bắc Giang. 1 chủng thuộc loài Cordyceps nutans thu ựược ở đắk Lắk, 1 chủng thuộc loài Cephalosporium lanosoniveum thu ựược ở đắk Lắk , 1 chủng thuộc loài
Toxicocladosporium sp. thu ựược ở đắk Lắk và 1 chủng thuộc loài
Paecilomyces cicadae thu ựược ở đắk Lắk.
trên rệp sáp cà phê ở Việt Nam bao gồm: 8 chủng thuộc loài Metarhizium anisopliae, 10 chủng thuộc loài Beauveria bassiana, 1 chủng thuộc loài
Cordyceps nutans và 1 chủng thuộc loài Cephalosporium lanoso-niveum. Riêng ở các tỉnh Tây Nguyên ựã thu ựược 12 chủng thuộc 4 loài nấm ký sinh rệp sáp hại cà phê, trong ựó 6 chủng thuộc loài Metarhizium anisopliae, 4 chủng thuộc loài
Beauveria bassiana, 1 chủng thuộc loài Cordyceps nutans và 1 chủng thuộc loài
Cephalosporium lanoso-niveum. Với thành phần các chủng ựã thu thập rất phong phú sẽ là nguồn vật liệu phục vụ cho các thắ nghiệm ựánh giá ựộc lực và lựa chọn ựể sản xuất chế phẩm.