VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.điều tra thu thập, phân lập, giám ựịnh và ựịnh loại các chủng nấm ký sinh
ký sinh
2.3.2.1. Thu thập, phân lập và giám ựịnh các chủng nấm côn trùng
Phương pháp ựiều tra khảo sát thực ựịa: điều tra các tác nhân sinh học có ắch ngoài tự nhiên theo phương pháp ựiều tra cơ bản. Xác ựịnh các mẫu rệp sáp bị nấm ký sinh bằng phương pháp quan sát ban ựầu các mẫu vật theo triệu chứng của nấm côn trùng như: Bề mặt có lớp bào tử, côn trùng ký chủ bị triệu chứng chết cứngẦ Mẫu vật thu thập ựược bảo quản riêng trong các ống túyp có nút bông ựã ựược khử trùng sau ựó ựem về phòng thắ nghiệm bảo quản ở nhiệt ựộ 40C ựể sau ựó lựa chọn và phân lập.
Phân lập nấm theo phương pháp của Barnett và Hunter (1972) và theo phương pháp thường quy của Viện Bảo vệ thực vật. Tiến hành phân lập theo 3 cách:
- Cách 1: Khử trùng bề mặt mẫu vật bằng dung dịch cồn 50% trong 30 giây, sau ựó nghiền mẫu trong cối sứ, thêm 1 ựến 5 ml nước vô trùng, dùng micro pipet hút 0,1 ml cho vào ựĩa môi trường và dùng trang thủy tinh trang kắn bề mặt.
- Cách 2: Với mẫu vật có lớp bào tử nấm bên ngoài ựược quan sát là sạch thì tiến hành dùng que cấy lấy bào tử trên bề mặt côn trùng ký chủ và cấy trực tiếp vào ựĩa môi trường.
- Cách 3: Dùng dao mổ cắt mẫu vật thành các mảnh nhỏ và lấy các mảnh nhỏ ựặt lên bề mặt môi trường.
Môi trường dùng trong phân lập bao gồm Sabauraud, N1, N2 và Czapek-Dox.
* Phương pháp giám ựịnh loài bằng công nghệ DNA Tách chiết ADN
Vi sinh vật ựược nuôi cấy trên môi trường thắch hợp. Lấy 1 vòng que cấy khuẩn ty vào ống eppendorf vô trùng, thêm 500 ộl 2ừSSC vào mỗi ống. Lắc ựều và giữ ở 99ồC trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng. Thêm khoảng 100 ộl hạt thủy tinh có ựường kắnh 0,2 - 0,5 mm (Roth, đức), 100 ộl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 ộl nước cất vô trùng. Lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, đức) sau ựó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phắa trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết ựược giữ ở -20ồC.
định tên vi sinh vật bằng giải trình tự
Phân ựoạn rADN của vi sinh vật ựược khuyếch ựại bằng mồi ITS1, NL4 trên thiết bị GeneAmpệ PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) với chương trình nhiệt ựược thiết lập với pha biến tắnh ở 94ồC trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94ồC trong 30 giây, 52 ồC trong 30 giây và 72 ồC
trong 1 phút). Quá trình khuyếch ựại ựược hoàn tất ở 72 ồC trong 7 phút và sau ựó sản phẩm PCR ựược bảo quản ở 10 ồC.
Sản phẩm PCR sau khi khuyếch ựại ựược tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, đức) theo khuyến cáo của hãng. Trình tự ADN ựược ựọc bằng phương pháp Ộdideoxy chain terminationỢ với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy ựọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem ựược sử dụng. Các chuỗi ADN ựược so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide ựặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbịnlm.nih.gov). Các chuỗi liên quan ựược chuyển tải về sau ựó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999) và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al., 1997).
Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại
ITS1 5Ỗ to 3Ỗ: TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4 5Ỗ to 3Ỗ: GGTCCGTGTTTCAAGACGG
2.3.2.2. Thắ nghiệm lựa chọn môi trường nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy trên 5 loại môi trường, mỗi loại môi trường ựược nuôi cấy trên bình tam giác 500 ml và nhắc lại 5 lần, nuôi cấy trong 7 ngày ựược ựặt trên máy lắc ở tốc ựộ 250 vòng/phút. Sau 7 ngày nuôi cấy tiến hành tách triết enzyme và ựánh giá enzyme trên 5 cơ chất khác nhau bao gồm: Chitine-T, chitine-C, lipid, cellulose và glucosẹ Sợi nấm và bào tử trồi ựược thu lại và ựem sấy khô ựến trọng lượng không ựổi ựể ựánh giá khả năng phát triển sinh khốị
- Nghiên cứu ựánh giá xác ựịnh bộ chủng giống nấm có hoạt tắnh cao trên cơ sở xác ựịnh khả năng sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể sau ựó tiến hành tách triết dịch enzyme và thử trên các cơ chất bao gồm: Chitine, lipid, cenllulose và glucose bằng phương pháp ựục lỗ có ựường
kắnh 1cm trên môi trường thạch có chứa cơ chất và nhỏ dịch enzyme ựầy lỗ thạch ựể sau 16h và dùng thuốc thử ựể xác ựịnh ựường kắnh vòng phân giảị
2.3.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng nấm ở các mức nhiệt ựộ khác nhau
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ tới sự phát của các chủng nấm: Các chủng nấm ựược cấy trên môi trường N1 trong ựĩa Petri, mỗi chủng cấy 100 ựĩa, cấy 1 ựiểm ở chắnh giữa ựĩạ Theo dõi sự phát triển của nấm bằng mắt thường. Tiến hành theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc thông qua việc ựo ựường kắnh khuẩn lạc qua các ngày theo dõi, ựếm lượng bào tử và so sánh giữa các chủng.
Các ựĩa sau khi cấy ựược ựặt trong tủ ựịnh ôn ở các mức nhiệt ựộ thắ nghiệm là 150C, 200C, 250C, 300C và 350C. Sau ựó theo dõi sự phát triển của nấm thông qua việc ựo ựường kắnh và ựếm số bào tử sau 3; 5; 7; 10 và 15 ngày nuôi cấỵ
Chỉ tiêu theo dõi
- đường kắnh khuẩn lạc.
- Số lượng bào tử hình thành
Phương pháp ựếm bào tử: Dùng buồng ựếm hồng cầu và ựược tiến hành như sau:
Nghiền 1 cm2 khuẩn lạc nấm vào 10 ml nước cất và lắc ựều, lấy 1 ml dịch bào tử vừa pha cho vào 9 ml nước cất, cứ hòa như vậy với tỷ lệ 1 ml dịch bào tử với 9 ml nước cất cho ựến khi ựếm ựược bào tử (10-4 Ờ 106)
2.3.2.4. đánh giá và tuyển chọn ựộc lực các chủng nấm côn trùng
- đánh giá ựộc lực của các chủng nấm bằng enzyme ngoại bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi lắc trên môi trường dịch thể sau các ngày nuôi cấy N1, tiến hành thu dịch thể có chứa enzym ngoại bàọ Sử dụng môi trường ựệm Citrat photphat ựể thử khả năng hình thành một số enzym ngoại bào của nấm.
Na2HPO4.12H2O 0.615g
Axit citric 0.25g
Agar 2g
Nước cất 100ml
Bổ sung mỗi loại 0.1 % (Tween 80, giấy lọc, vỏ tôm, vỏ cua, Glucoza) vào từng bình môi trường .
Khử trùng 1 atm/30Ỗ sau ựó ựổ ra ựĩa petri, ựể thạch nguội sau ựó khoan thạch và nhỏ dịch nuôi vi nấm (dịch enzym thử) vào các lỗ khoan. ủ ở 28- 300C trong 16 giờ, tráng bằng thuốc thử lugol lên bề mặt thạch ựể cho tới khi xuất hiện vòng. đổ thuốc thử ựi và ựo vòng phân giải
Vòng phân giải ựược tắnh toán theo công thức sau Vòng phân giải = (D-d) mm
D: đường kắnh vòng phân giải d: đường kắnh lỗ khoan.
- đánh giá ựộc lực của các chủng nấm trên cơ thể rệp sáp
Các chủng sau khi ựã lựa chọn có khả năng sinh enzyme cao ựược ựánh giá trên cơ thể rệp sáp bằng phương pháp ựánh giá ựộc lực của các chủng nấm (Viện BVTV, 1997, 1998). Tiến hành nhân nuôi loài rệp tua ngắn (Planococcus kraunhiae Kuwana) trong phòng thắ nghiệm bằng thức ăn ưa thắch của loài rệp này là quả bắ ngô và củ khoai tây, trước ngày thắ nghiệm tiến hành áp sát các củ khoai tây vào quả bắ nuôi rệp ựể rệp di chuyển sang, sau ựó loại bỏ bớt ựể cho ựủ 50 rệp tuổi 2 trên mỗi củ khoai tây, ựể tiếp 1 ngày cho rệp ổn ựịnh và tiến hành thử nghiệm.
+ Mỗi công thức thắ nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 50 cá thể rệp + Thử nghiệm khả năng gây bệnh của nấm ựối với rệp sáp, chúng tôi sử dụng các chủng nấm sau khi ựã ựược ựánh giá hoạt tắnh của enzymẹ
dùng que cấy gạt bào tử trên bề mặt của thạch ựể hòa tan bào tử vào nước và ựổ vào cốc ựựng.
+ đếm số lượng bào tử và pha tới nồng ựộ 107, có bổ sung chất bám dắnh với nồng ựộ 0,3 phần vạn.
- Sử dụng bình phun tay ựể phun dịch bào tử nấm ướt ựều bề mặt trên củ khoai tây nuôi rệp.
Chỉ tiêu theo dõi:
Số rệp chết sau các ngày thử nghiệm
2.3.2.5. Nghiên cứu các phương pháp bảo quản các chủng giống gốc
Cấy các chủng giống gốc trong ống môi trường N1 và ựể ở 250C trong 7 ngày ựể các chủng nấm hình thành bào tử. Mỗi công thức cho mỗi chủng cấy 100 ống.
Sau ựó tiến hành bảo quản bằng 3 phương pháp:
- Bảo quản thường: Các ống giống sẽ ựược ựặt trong ựiều kiện tủ lạnh 40C.
- Bảo quản hút chân không: hút chân không trong 1 tuần ựể không còn tồn tại không khắ trong bảo quản, sau ựó ựặt trong ựiều kiện 40C.
- Bảo quản bằng glyceryl: đổ dung dịch glyceryl 5% ngập hết bề mặt của ống giống nấm ựã cấy, sau ựó ựặt trong ựiều kiện 40C.
Sau thời gian bảo quản, 3 tháng 1 lần lấy giống ra và pha loãng ở nồng ựộ 10-5 và cấy lại trên môi trường, sau ựó 3-5 ngày ựếm số bào tử mọc mầm.
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử nảy mầm
2.3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống rệp sáp hại cà phê chống rệp sáp hại cà phê
2.3.3.1. Thắ nghiệm lựa chọn môi trường lên men xốp
Xác ựịnh môi trường sản xuất chế phẩm tối ưu, vừa thắch hợp cho sự phát triển của nấm, vừa tận dụng ựược phế thải nông sản rẻ tiền.
Tiến hành thắ nghiệm trên 5 công thức giá thể nuôi cấy khác nhau:
- CT1: Giá thể gạo: 100% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- CT2: Giá thể gạo + Ngô: 50 Ờ 50
- CT3: Giá thể ngô: 100%
- CT4: Giá thể gạo + bã mắa: 50 Ờ 50
- CT5: Giá thể bã mắa: 100%
Sau khi cấy nấm trên 5 loại giá thể trên, sau 7 ngày tiến hành sấy khô và lấy mẫu 1gr chế phẩm ựể ựếm số lượng bào tử của từng công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử/gr chế phẩm
2.3.3.2. Nghiên cứu một số dạng phụ gia thắch hợp ựể tạo dạng và kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm
Sau khi nhân sinh khối và tách chiết bào tử tinh của nấm, tiến hành nghiên cứu các dạng phụ gia ựể tạo dạng chế phẩm ựảm bảo chất lượng cao nhất và kéo dài thời gian bảo quản. Chúng tôi lựa chọn và xác ựịnh 3 loại phụ gia ựể tiến hành thắ nghiệm, 3 loại phụ gia này chúng tôi chuẩn bị ựăng ký bản quyền sở hữu trắ tuệ nên xin phép không nêu rõ thành phần mà ký hiệu là PG1, PG2, PG3.
Các dạng phụ gia ựược phối trộn với bào tử tinh theo 3 tỷ lệ về trọng lượng như sau:
CT1: Bào tử nấm
CT2: Bào tử nấm Ờ Phụ gia: 1/6 CT3: Bào tử nấm Ờ Phụ gia: 1/9 CT4: Bào tử nấm Ờ Phụ gia: 1/12
Sau khi phối trộn phụ gia và ựóng gói, tiến hành bảo quản ở ựiều kiện thường (phòng thắ nghiệm), sau mỗi tháng bảo quản tiến hành lấy mẫu và kiểm tra chất lượng chế phẩm sau các tháng bảo quản bằng phương pháp pha loãng ựến 10-5 và cấy trên các ựĩa môi trường N1. Chất lượng chế phẩm ựược
ựánh giá thông qua chỉ tiêu số lượng bào tử sống/gr chế phẩm. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử nảy mầm.
2.3.3.3. Nghiên cứu hỗn hợp chất bám dắnh khi sử dụng chế phẩm
để tìm hiểu ảnh hưởng của các chất bám dắnh ựến khả năng nảy mầm của bào tử nấm khi hỗn hợp với chúng trong sử dụng phun rải trên ựồng ruộng, chúng tôi tiến hành ựánh giá trên môi trường nuôi cấy ựể biết ựược khả năng nảy mầm của bào tử. Hỗn hợp nồng ựộ của 3 loại chất bám dắnh là Tween 80, Enomil và nước rửa chén Sunligh theo khuyến cáo của nhà sản xuất là 0,3 phần vạn, bổ sung vào môi trường và sau ựó dung dịch hòa từ chế phẩm ở nồng ựộ 10-5 vào các ựĩa, ựặt trong ựiều kiện ựịnh ôn 250C trong 5 ngày và tiến hành ựếm số lượng bào tử nảy mầm.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử nảy mầm.
2.3.3.4. Nghiên cứu ựề xuất các bước trong quy trình sản xuất chế phẩm
- Công ựoạn 1: Sản xuất giống cấp 1
Giống cấp 1 ựược cấy trên môi trường N1 hoặc Sabauraud trong ống nghiệm ở ựiều kiện phòng từ 5 ựến 7 ngàỵ Khi bề mặt hình thành và phủ kắn lớp bào tử là ựủ tiêu chuẩn ựể ựưa vào sản xuất giống cấp 2.
- Công ựoạn 2: Giống cấp 2
Sử dụng gạo ựã luộc và sấy khô, cân 120gr cho vào trong bình tam giác 500ml thêm 60ml nước dung dịch CaCO30,5%, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. để nguội môi trường và cấy giống cấp 1 vào và nuôi ở ựiều kiện phòng (20 Ờ 300C) từ 5 ựến 7 ngàỵ
- Công ựoạn 3: Nhân sinh khối
Cân 200gr gạo trong mỗi túi nilon chịu nhiệt có cổ túi và nút bông, thêm 70ml nước vào mỗi túi, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. để nguội và cấy giống cấp 2 vàọ
ựể thoáng khắ sau ựó 3 ngày tiến hành ựổ ra nia ở ựộ dầy 3cm, tiếp tục ựể hình thành bào tử trong 2 ngày sau ựó ựem sấỵ
- Công ựoạn 4: Sấy chế phẩm
Sấy trong tủ sấy có ựuổi khắ ở ựiều kiện 380C trong 5Ờ 8 giờ, kiểm tra thủy phần tới 8% là ựạt. Với chế phẩm tinh thì tiếp tục công ựoạn 5 (tách triết bào tử), còn chế phẩm thô thì tiếp theo công ựoạn 6.
- Công ựoạn 5: Tách chiết bào tử
đổ chế phẩm ựã sấy khô vào máy tách chiết bào tử ựể thu bào tử tinh. Dùng máy tách bào tử có mặt sàng 0,3 mm ựặt trên máy lắc ngang tốc ựộ 200 lần/phút, thu bào tử tinh từ phễu thu dưới mặt sàng.
- Công ựoạn 6: Kiểm tra chất lượng chế phẩm
Lấy mẫu 1gr chế phẩm pha loãng ở 10-5 và cấy 0,1ml dịch nên ựĩa môi trường nuôi cấy N1 hoặc Sabauraud ựặt ở 280C trong 5 ngày ựể ựếm số bào tử sống. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Công ựoạn 7: đóng gói và bảo quản chế phẩm
+ Với sản phẩm thô: đóng gói và bảo quản trong ựiều kiện phòng.
+ Với sản phẩm tinh (bào tử tinh): Trộn với phụ gia PG1 với tỷ lệ 10% bào tử và 90% phụ gia, sau ựó ựóng gói và bảo quản.
2.3.4. Khảo nghiệm chế phẩm và xây dựng mô hình ựánh giá hiệu quả phòng chống rệp sáp hại cà phê phòng chống rệp sáp hại cà phê
2.3.4.1. đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong phòng thắ nghiệm
- Phương pháp nhân nuôi rệp sáp trong phòng thắ nghiệm: Theo phương pháp nhân nuôi của Quách Thị Ngọ và cs., (2004). Rệp sáp là loài ựa thực nên khi nhân nuôi trong phòng thắ nghiệm với số lượng lớn tiến hành nhân nuôi trên quả bắ ựỏ hoặc trên củ khoai tâỵ
- địa ựiểm ựánh giá: Tại Viện Bảo vệ thực vật và Tại Viện Khoa học Nông lâm nghiệp Tây Nguyên.
để ựánh giá hiệu lực của các chế phẩm nấm phòng chống rệp sáp hại cà phê, chúng tôi tiến hành các ựánh giá trong phòng, nhà lưới theo 10 TCN (216 -2003): Quy phạm khảo nghiệm hiệu lực của phân bón hoặc chế phẩm vi sinh ựối với cây trồng.
+ Mỗi công thức thắ nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 50 cá thể rệp tuổi 2 ựến tuổi 3.
- Phương pháp: Pha 3 nồng ựộ dịch phun cho 3 công thức: CT1: 10 gr chế phẩm/1 lắt nước
CT2: 5 gr chế phẩm/1 lắt nước CT3: 2,5 gr chế phẩm/1 lắt nước
Bổ sung chất bám dắnh ở nồng ựộ 0,3 phần vạn Sử dụng bình phun tay ựể phun ướt bề mặt
Sau khi phun phải theo dõi hàng ngày về: Số rệp chết qua các ngày
2.3.4.2. đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm trong nhà lưới
- Phương pháp nhiễm rệp sáp lên cây cà phê: Tiến hành nhiễm rệp sáp lên