Nhận thấy kết quả nghiên cứu bằng ba phương pháp: hình thái, chỉ thị phân tử ADN và sắc kí đồ các thành phần đều cho ra một kết quả khá tương đồng nhau. Trong đó với phần nghiên cứu hình thái thực vật và HPTLC sử dụng sự hỗ trợ từ phần mềm phân tích đa biến Pcord 4 đều cho kết quả khá tương đồng. Kết quả này cũng gần như tương đồng với kết quả phân tích chỉ thị phân tử ADN. Tuy nhiên đáng tiếc dữ liệu ADN trên genbank chưa được đầy đủ nên việc xác định tên khoa học và phân loại các loài trong nghiên cứu vẫn dựa trên các đặc điểm hình thái là chủ yếu.
61
KẾT LUẬN
1.Về tính đa dạng đa dạng của các loài Kim ngân ở miền Bắc Việt Nam
Đã thu thập, mô tả đặc điểm hình thái của 7 mẫu KN1, KN2, KN3, KN4, KN5, KN6, KN7 và đối chiếu với các tài liệu đã công bố và sơ bộ giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu lần lượt là: Lonicera confusa DC., Lonicera dasystyla
Rehder, Lonicera sp.1, Lonicera sp.2, Lonicera japonica Thunb., Lonicera macratha (D.Don) Spreng, Lonicera reticulata Champ.
Đã mô tả đặc điểm cấu tạo giải phẫu thân và lá của 7 mẫu nghiên cứu trong chi
Lonicera L.
Đã giải trình tự đoạn ITS (650 nucleotid) của 7 mẫu nghiên cứu và xây dựng được cây phát sinh loài của 7 mẫu, duy nhất chỉ có mẫu KN5 chưa thu được kết quả mong muốn. Theo đó 6 mẫu nghiên cứu KN1, KN3, KN4, KN6, KN7, KN8 thuộc cùng một nhóm, tách biệt hẳn với mẫu KN2. 7 mẫu kim ngân có hệ số tương đồng di truyền 98% - 99%.
2.Bán định lượng hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu nghiên cứu
Hàm lượng acid chlorogenic trong 7 mẫu Kim ngân được bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) dao động trong khoảng 0,005% - 0,119%. Trong đó mẫu Kim Ngưu- Hà Nội đạt hàm lượng cao nhất 0,119%.
62
KIẾN NGHỊ
1.Tiếp tục nghiên cứu các đoạn trình tự ADN mã hóa khác của các loài trong chi
Lonicera spp.. để khẳng định chắc chắn hơn sự khác biệt dưới loài.
2.Cố định các mẫu kim ngân thu hái tại các địa phương khác nhau để tiến hành định lượng hàm lượng acid chlorogenic và hàm lượng các thành phần khác có trong cây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm chọn được giống có chất lượng tốt nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ môn Thực vật (2002), Thực tập Thực vật và nhận biết cây thuốc, Trung tâm thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương,… (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tập 2, trang 107- 109.
3. Đỗ Tất Lợi (2007), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 75-77.
4. GS.TS. Nguyên Văn Thanh TS. Trần Cát Đông, PGS.TS. Trần Thu Hoa, TS. Nguyễn Trọng Hiệp, ThS. Huỳnh Thị Ngọc Lan (2009), Công nghệ Sinh học Dược, NXB Giáo Dục.
5. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. 6. Hộ. Phạm Hoàng (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển 3.
7. Lê Đình Bích Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y Học, trang 297-298. 8. Lê Duy Thành Đỗ Lê Thăng, Đinh Toàn Long, et al (2009), Cơ Sở Sinh Học
Phân Tử, NXB Giáo Dục.
9. Nguyễn Bá (2010), Hình thái học thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục.
10. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, trang 632-625.
11. Võ Văn Chi (1999), Từ điển thực vật thông dụng, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
12. Vũ Thị Thanh Thuý (2013), Nghiên cứu sự đa dạng các loài trong chi Gymnema R.Br. sử dụng chỉ thị phân tử ITS, Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tiếng Anh
13. Wagner H et al. Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs, pp. 592-593.
14. Yang Kuoh-Cheng Chiu Shau-Ting (1998), "Caprifoliaceae, In Editorial Committee of the Flora of Taiwan", Flora of Taiwan, Volume IV: Angiosperms - Dicotyledons [Diapensiaceae - Compositae].
15. Qiner Yang et al (2011), "Caprifoliaceae". Flora of China, (Editorial Committee, Wu Zhengyi, Peter. H. Raven, Hong Deyuan),
16. Álvarez I. Wendel J.F (2003), "Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference", Mol Phylogenet Evol, 29(3), pp. 417-34.
17. Baldwin B.G et al (1995), "The its Region of Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny", Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2), pp. 247-277.
18. Chai XY Li P, Tang LY (2004), "Studies on chemical constituents in dried buds of Lonicera confusa", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 29(9), pp. 865 – 7. 19. Chai XY Li SL, Li P. (2005), "Quality evaluation of Flos Lonicera through a
stimultaneous determination of seven saponins by HPLC with ELSD", J Chromtogr Annals of the Missouri Botanical Garden, 1070(1-2), pp. 43 – 8. 20. Chase M.W et al (2005), "Land plants and DNA barcodes: short-term and
long-term goals", Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360(1462), pp. 1889- 95.
21. Chen Yu, Shan Yu, Zhao You Yi, et al (2012), "Two new triterpenoid saponins from Lonicera macranthoides", Chinese Chemical Letters, 23(3), pp. 325-328.
22. Hebert P.D et al (2004), "Identification of Birds through DNA Barcodes",
PLoS Biol, 2(10), pp. 312.
23. Hebert P.D et al (2003), "Biological identifications through DNA barcodes",
Proc Biol Sci, 270(1512), pp. 313-21.
24. Hebert Ratnasingham S. and P.D. (2007), "Bold: The Barcode of Life Data System ( http://www.barcodinglife.org )", Mol Ecol Notes, 7(3), pp. 355-364. 25. Hollingsworth P.M etal (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proc Natl
26. Hollingsworth P.M. Bateman R.M., and Gornall R.J (1999), "Molecular Systematics and Plant Evolution", Taylor & Francis.
27. Ji L Pan J, Xu Z (1990), "GC-MS analysis of essential oil flowers of Lonicera japonica Thunb", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 15(11), pp. 680 – 2.
28. Joshi Devi Datt (2012), Herbal Drugs and Fingerprints, Spinger.
29. Kakuda R Imai m, Yaoita Y, Maichida K, Kikuchi M (2000), ""Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera Japonica"", Phytochemistry, 55(8), pp. 879 – 81.
30. Kawai H Kuroyanagi M, Umechara K, Ueno A, Satake M (1988), "Studies on the Saponins of Lonicera japonica Thunb", Chem Pharm Bull, 36(12), pp. 4769 – 4775.
31. Kress W.J et al (2009), "Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest dynamics plot in Panama", Proc Natl Acad Sci USA, 106(44), pp. 18621-6.
32. Kwak WJ Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH (2003), "Studies on the Saponins of Lonicera japonica Thunb"", ChemPharm Bull, 51(3), pp. 333 – 5.
33. L Kress W. J. and Erickson D. (2012), "DNA Barcodes: Methods and Protocols", Human Press.
34. Li H Zhang Z, Li P (2002), "Comparative study on colatile oils n flower and stem of Lonicera japonica", Zhong Yao Cai, 25(7), pp. 476 – 7.
35. Li HJ Li P, Ye WC (2003), ”Determination of five major iridoidglucosides in FlosLonicerae by high-performance liquid chromatography coupld with evaporative light scrattering detection", J Chromatogr A, 1008(2), pp. 167 – 72.
36. Liang Y.Z. P. Xie, and K. Chan (2004), “Quality control of herbal medicines”,
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 812(1-2), pp. 53-70.
37. LUO Yong-Jing LI Hui-Jun, LI Ping, ZHANG Li (2009), "A New Triterpenoid Saponin from Flower Buds of Lonicera dasystyla", Chinese Journal of Natural Medicines, 7(6), pp. 405 -408.
38. Machida K Sasaki H, Iijima T, Kikuchi M (2002), "Studies on the Constituents of Lonicera Species XVII, New iridoid glycosides of the stems and leaves of onicera japonica Thunb", Chem Pharm Bull, 50(8), pp. 1041 – 4. 39. Naugžemys Donatas, Žilinskaitė Silva, Denkovskij Jaroslav, Patamsytė Jolanta, Literskis Justinas, Žvingila Donatas (2007), "RAPD based study of genetic variation and relationships among Lonicera germplasm accessions",
Biologija, 53(3).
40. Newmaster S.G et al (2008), "Testing candidate plant barcode regions in the Myristicaceae", Mol Ecol Resour, 8(3), pp. 480-90.
41. P.-t. Bingtao Li M. G. G. W. D. S. and Tsiang Ying L. (1995), "Asclepiadaceae R. Brown. In Wu, Z. Y. & P. H. Raven, eds. 1995. Flora of China", Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis.
42. Savolainen V et al (2005), “Towards writing the encyclopedia of life: an introduction to DNA barcoding”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360(1462), pp. 1805-11.
43. Schoch C.L et al (2012), "Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi", Proc Natl Acad Sci USA, 109(16), pp. 6241-6.
44. Shoyama Yukihiro (2011), "“Quality control of herbal medicines and related areas”", InTech.
45. Srivastava ManMohan (2011), High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), Spinger.
46. Suh SJ Chung TW, Son MJ, Kim SH, Moon TC, Son KH, Kim HP, Chang, CH HW. Kim (2006), "The naturally occurring biflavonoid, ochnaflavone, inhibits LPS-induced iNOS expression, which is meditated by ERK ½ via NF- kappaB regulation, in RAW 264.7 cells", Arch BiochemBiophys, 447(2), pp. 136 – 46.
47. Tang W Eisenbrand G "Chinese drugs of plant origin", Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York..
48. Wang G Zhu X, Wang J, Jia W, Yuan Y, Nan P, Yuan P (1992), "Analysis of chemical constituent of essential oil in Lonicera japonica Thunb, cultivated on the northern plain of Henan Province", ZhongguoZhong Yao ZaZhi, 17(5), pp. 268 – 70.
49. Wing-Cheung Leung H Kuo CL, Yang WH, Lin CH, Lee HZ (2006), "Antioxidant enzymes activity involvement n luteolin-induced human lungsquamous carcinoma CH27 cell apoptosi", Eur J Pharmacol, 534(1-3), pp. 12 – 8.
50. Zhong Zhang Aimin Luoc, Kai Zhongc, Yina Huang, et al, (2013), "a- Glucosidase inhibitory activity by the flower buds of Lonicera japonica
Thunb", Journal of Functional Foods 5, pp. 1253-1259.
Internet:
51. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank. 52. http://www.theplantlist.org/.
PHỤ LỤC 1a: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN1- Hoành Bồ
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 1b: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN2 – Vườn Thực Vật
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 1c: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN3 – Kim Ngưu
MỒI XUÔI ITS1
MỒI NGƯỢC ITS4
PHỤ LỤC 1d: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN4 – Bắc Kạn
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 1e: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN5– Nhập nội
MỒI XUÔI ITS1
PHỤ LỤC 1f: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN6 – SaPa
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 1g: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN7 – Hà Giang 1
MỒI XUÔI ITS1
PHỤ LỤC 1h: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU KN8 – Hà Giang 2
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPTLC)
PHỤ LỤC 2a: HÌNH ẢNH PIC SẮC KÝ MẪU CHUẨN ACID CHLOROGENIC Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU
PHỤ LỤC 2E: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ BÁN ĐỊNH LƯỢNG
PHỤ LỤC 5: BẢNG MA TRẬN HÌNH THÁI CÁC MẪU KIM NGÂN NGHIÊN CỨU.
STT Đặc điểm Mã hóa KN1 KN2 KN3 KN4 KN5 KN6 KN7
1
Lõi thân 1= Rỗng; 2= không
rỗng 1 1 2 1 1 1 2 2 Hình dạng gốc lá 1= Nhọn, 2= tim 1 1 2 2 2 2 2 3 Kích thước phiến lá 1= Ngắn (3-6cm); 2= Dài (6-8cm) 1 1 1 2 1 2 2 4 Bề mặt lá 1= Có lông đều 2 mặt; 2= Nhẵn 2 mặt; 3= Mặt trên ít lông mặt dưới nhiều lông
1 2 1 1 3 3 3 5 Màu sắc hai mặt lá 1= Mặt dưới trắng bạc; 2=Xanh cả hai mặt 1 1 2 2 1 1 1 6
Chiều dài cuống lá 1= Ngắn (≤ 5mm);
2= Dài (> 5mm) 1 2 1 2 2 1 1 7 Chiều dài cuống
hoa 1= Dài (>1mm); 2= Ngắn (≤ 1mm) 1 1 2 2 2 1 2 8 Chiều dài lá bắc cụm hoa 1= Ngắn (≤2mm); 2= Dài (>2mm) 2 1 2 2 2 2 2 9 Chiều dài lá bắc hoa 1= Ngắn (≤1mm); 2= Dài (>1mm) 1 1 2 2 1 1 1 10
Chiều dài lá đài 1= Ngắn (≤1mm); 2=
Dài (>1mm) 1 1 2 2 2 1 2 11 Bề mặt ngoài đài lá đài 1= Phủ nhiều lông; 2= Phủ ít lông 1 2 1 1 1 1 1 12 Chiều dài tràng 1= Ngắn (≤5mm); 2= Dài (>5mm) 1 1 1 2 1 2 1 13 Bề mặt tràng 1= Phủ lông mặt ngoài; 2= Phủ lông 2 mặt 1 1 1 2 2 2 2 14 Lông tiết ở mặt ngoài tràng 1= Có; 2= Không có 2 1 1 1 2 1 2 15 Chiều dài chỉ nhị 1= Ngắn (≤ 4cm); 2= 1 2 2 2 2 2 1
Dài ( > 4cm)
16 Bề mặt bầu 1= Nhẵn; 2= Có lông 1 2 2 2 2 1 2 17 Chiều dài vòi
nhụy
1= Dài (> 6cm); 2=
Ngắn (≤ 6 cm) 2 2 1 1 1 1 2
18
Kiểu đính noãn 1= Trung trụ; 2=