2.4.4.1. Xác định sắc kí đồ bằng HPTLC.
a. Chuẩn bị dịch chiết: Cân chính xác khoảng 1-2 g dược liệu (Bảng 2.4), nghiền nhỏ, chiết siêu âm 3 lần bằng dung môi MeOH. Lần 1 chiết với 20ml Methanol trong 45 phút, lần 2 và lần 3 với 10 ml Methanol trong 30 phút. Dịch chiết 3 lần được gộp lại lọc và cô đến cắn. Hòa tan cắn bằng 10ml nước và 20 ml EtOAc. Lắc và thu lấy phân đoạn EtOAc, cô cạn đến cắn. Hòa tan cắn bằng 4ml Methanol thu được dịch chấm [13].
22
Bảng 2.4. Chuẩn bị dịch chiết theo từng mẫu nghiên cứu
KN1 KN2 KN3 KN4 KN5 KN6 KN7
Hoa 1,0379 g 1,0778 g 1.0254 g 1.0468 g 1.0359 g 1.0521 g 1.0626 g Cuộng 2,0648 g 2,0877 g 2.0576 g 2.0320 g 2.0376 g 2.0483 g 2.0627 g Lá 2,0193 g 2.0763 g 2.0211 g 2.0481 g 2.0481 g 2.0812 g 2.0259 g
b. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
Bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel GF254 (Merck) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ, để nguội để triển khai sắc ký. Kích thước bản mỏng 20 ×10 cm.
Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 8mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 10,0mm. Độ rộng của vết chấm là 6,0mm và thể tích chấm mỗi vết là 6,0 µl.
Hệ dung môi khai triển:
Theo nghiên cứu của Phạm Lý Hà đã khảo sát 13 hệ dung môi chạy sắc kí lớp mỏng và đã chọn ra được hệ tách vết tốt nhất là: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13). Chúng tôi đã tiếp tục tiến hành tối ưu hóa hệ này để đạt được hiệu quả tách vết tốt hơn phục vụ mục định bán định lượng. Hệ dung môi sau khi được tối ưu hóa là:
Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 9: 9: 26) - Điều kiện triển khai sắc ký lớp mỏng:
+ Điều kiện môi trường: Nhiệt độ 280C, độ ẩm tương đối 69%.
+ Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; thể tích dung môi khai triển: 10,0 ml. + Thời gian bão hòa dung môi: 30 phút.
+ Thời gian sấy bản mỏng: 10 phút.
+ Quãng đường di chuyển của pha động: 80,0 mm.
Bản mỏng được hiện vết bằng cách soi dưới đèn UV bước sóng 254 nm, 366 nm.
c. Xây dựng cây phân loại các mẫu dựa trên vân tay sắc kí.
Cây phân loại được xác định dựa trên sự xuất hiện/không xuất hiện của các vết trên sắc ký đồ các mẫu: Dữ liệu này được mã hóa và lập thành ma trận, nhập vào phần mền Pcord, phiên bản 4.0. Cây phân loại của các mẫu nghiên cứu được thiết lập
23
dựa trên phép phân tích chùm theo phương pháp khoảng cách liên kết trung bình UPGMA.
2.4.3.2. Quy trình bán định lượng
a.Mẫu chuẩn: pha dãy chuẩn gồm các nồng độ như bảng 2.5.
Bảng 2.5 Dãy nồng độ của dung dịch chuẩn (mg/ml)
1 2 3 4 5
Nồng độ 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
b.Mẫu thử: chuẩn bị theo mục a phần 2.4.3.1.
c.Điều kiện triển khai sắc ký: theo mục b phần 2.4.3.1.
Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và các mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng. Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ acid chlorogenic của các mẫu chuẩn. Xác định nồng độ acid chlorogenic trong các mẫu thử. Từ đó tính hàm lượng acid chlorogenic trong dược liệu theo công thức sau :
% acid chlorogenic=
100
Trong đó : C là nồng độ dung dịch thử (g/mL), độ pha loãng là 4. m là khối lượng bột dược liệu (g).
a là 100 lần độ ẩm của bột dược liệu (%).
Thẩm định phương pháp bán định lượng
Tính tuyến tính.
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn theo mục a phần 2.4.3.2, dãy mẫu chuẩn được pha theo bảng 2.5. Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung dịch chuẩn trên. Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Đánh giá: Dựa vào chỉ số sdv của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính. Trong nghiên cứu chấp nhận phương pháp có độ tuyến tính tốt với sdv < 5.
24
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm thực vật và đa dạng sinh học của chi Lonicera L. ở miền Bắc Việt Nam