3.3.1.Sắc ký lớp mỏng các mẫu Lonicera spp..
Hình ảnh sắc ký các mẫu được thể hiện ở hình 3.16, 3.17.
48
Hình 3.17 Sắc kì đồ hoa, cuộng, lá các mẫu KN5, KN6, KN7
Chú thích
1,5,9 : Hoa, Cuộng, Lá của KN1 13,16,19: Hoa, Cuộng, Lá của KN5 2,6,10: Hoa, Cuộng, Lá của KN2 14,17,20: Hoa, Cuộng, Lá của KN6 3,7,11: Hoa, Cuộng, Lá của KN3 15,19,21: Hoa, Cuộng, Lá của KN7 4,8,13: Hoa, Cuộng, Lá của KN4
Nhận thấy trên sắc kí đồ các mẫu quan sát tại bước sóng 254 nm các mẫu đều xuất hiện 1 vết đặc trưng của loài tại Rf 0,85.
Bảng 3.6 Bảng các vết sắc kí xuất hiện tại các mẫu
Rf Mẫu 0.26 0,32-0,34 0,44-0,45 0,56 0,65 0,68- 0,71 0,84 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2 2 1 2 2 1 1 3 2 2 1 1 2 1 1 4 2 1 1 2 2 1 1 5 2 1 1 1 2 1 1 6 2 1 1 1 2 1 1 7 2 2 1 2 2 1 1 8 2 2 1 2 2 1 1 9 2 1 1 2 2 1 1 10 1 1 1 1 1 1 1 11 2 1 1 1 1 1 1 12 2 1 1 1 1 1 1 13 2 2 1 1 2 1 1 14 2 2 1 2 2 1 1 15 1 2 1 2 2 1 1
49 16 2 2 1 2 1 1 1 17 2 2 1 2 2 1 1 18 2 2 1 1 2 1 1 19 1 1 1 1 1 1 1 20 1 2 1 2 2 1 1 21 1 2 1 1 1 1 1 Chú thích : 1 là có xuất hiện vết.
2 là không xuất hiện vết.
Khi ghép các vềt xuất hiện ở 3 mẫu Hoa, Cuộng, Lá của cùng 1 loài thu được bảng các vết sắc kí xuất hiện ở mỗi loài như sau:
Bảng 3.7 Bảng các vết sắc kí xuất hiện khi tổng hợp các mẫu
Rf Mẫu 0.26 0,34 0,45 0,56 0,65 0,71 0,84 1+5+9(KN1) 2 1 1 2 2 1 1 2+6+10(KN2) 1 1 1 1 2 1 1 3+7+11(KN3) 2 1 1 1 1 1 1 4+8+12(KN4) 2 1 1 1 1 1 1 13+16+19(KN5) 1 1 1 1 1 1 1 14+17+20(KN6) 1 2 1 2 1 1 1 15+18+21(KN7) 1 2 1 1 1 1 1
3.3.1.1. Mối quan hệ gần gũi các loài Kim ngân dựa trên sắc ký đồ HPTLC của hoa
Các mẫu được chia thành 3 nhóm: Nhóm 1: Lonicera sp.1 (KN3) và Lonicera japonica Thunb. (KN5), tách biệt hoàn toàn khỏi các nhóm còn lại; Nhóm 2:
Lonicera confusa DC. (KN1), Lonicera sp.2 (KN4) và Nhóm 3: Lonicera dasystyla
Rehder (KN 2), Lonicera macratha (D.Don) Spreng. (KN6) và Lonicera reticulata
Champ. (KN7) (Hình 3.18).
50
dựa theo sắc kí đồ HPTLC của hoa
3.3.1.2. Mối quan hệ gần gũi các loài Kim ngân dựa trên sắc ký đồ HPTLC của cuộng.
Ở mức tương đồng 75%, các mẫu được chia thành 3 nhóm: Nhóm 1: Lonicera confusa DC. (KN1); Lonicera dasystyla Rehder (KN 2); Nhóm 2: Lonicera reticulata Champ. (KN7); Nhóm 3: Lonicera sp.1 (KN3); Lonicera japonica
Thunb. (KN5); Lonicera sp.2 (KN4); Lonicera macratha (D.Don) Spreng. (KN6) (Hình 3.19).
Hình 3.19 Mối quan hệ gần gũi giữa các loài Kim ngân dựa theo sắc kí đồ HPTLC của cuộng
3.3.1.3. Mối quan hệ gần gũi các loài Kim ngân dựa trên sắc ký đồ HPTLC của lá.
Ở mức tương đồng 75%, các mẫu được chia thành 4 nhóm: Nhóm 1: Lonicera confusa DC. (KN1), Lonicera sp.2 (KN4); Nhóm 2: Lonicera macratha (D.Don) Spreng. (KN6); Nhóm 3: Lonicera dasystyla Rehder (KN 2), Lonicera sp.1 (KN3);
Lonicera japonica Thunb. (KN5); Nhóm 4: Lonicera reticulata Champ. (KN7) (Hình 3.20).
Hình 3.20 Mối quan hệ gần gũi giữa các loài Kim ngân dựa theo sắc kí đồ HPTLC của lá
51
3.3.1.4 Mối quan hệ gần gũi giữa các loài dựa theo sắc ký đồ HPTLC toàn mẫu
Sử dụng phần mềm phân tích đa biến pcord 4 với sắc kí đồ đã tổng hợp từ sự xuất hiện các vết trong hoa, lá, cuộng của các mẫu KN1 đến KN7 thu được cây phân loại 3.21.
Hình 3.21 Mối quan hệ gần gũi giữa các loài dựa theo sắc kí đồ HPTLC 3.3.2.Bán định lượng Acid Chlorogenic trong các mẫu Lonicera spp. bằng phương pháp HPTLC.
Kết quả bán định lượng được xác định theo bảng 3.8.
Bảng 3.8 Bảng kết quả bán định lượng hàm lượng acid chlorogenic
STT Cây Mẫu Khối lượng (g) Hàm ẩm
(%) Hàm lượng (%) 1. KN1 1 1,0379 6.13 0.062 2. 5 2,0648 5.89 0.012 3. 9 2,0193 5.98 0.017 4. KN2 2 1.0778 6.03 0.032 5. 6 2.0877 5.78 0.010 6. 10 2.0763 6.29 0.016 7. KN3 3 1.0254 6.35 0.066 8. 7 2.0576 5.67 0.019 9. 11 2.0211 6.05 0.034 10. KN4 4 1.0468 5.81 0.041 11. 8 2.0320 6.68 0.015
52
STT Cây Mẫu Khối lượng (g) Hàm ẩm
(%) Hàm lượng (%) 12. 12 2.0481 5.58 0.014 13. KN5 13 1.0359 6.05 0.003 14. 16 2.0376 5.51 0.002 15. 19 2.0481 6.59 0.001 16. KN6 14 1.0521 6.93 0.003 17. 17 2.0483 5.94 0 18. 20 2.0812 6.17 0.002 19. KN7 15 1.0626 10.06 0.007 20. 18 2.0627 8.09 0.005 21. 21 2.0259 9.04 0.001 3.3.3.Thẩm định phương pháp Tính tuyến tính:
Triển khai sắc ký với các nồng độ acid chlorogenic chuẩn từ 0,05 đến 0,4 mg/ml (bảng 3.9) thu được các vết có diện tích pic tương ứng, từ đó xây dựng được phương trình tuyến tính biểu thị sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic (hình 3.22, hình 3.23).
Bảng 3.9 Bảng nồng độ chất chuẩn và diện tích pic tương ứng
Mẫu Nồng độ(mg/ml) Diện tích pic
Chuẩn 1 0.05 5898.3 Chuẩn 2 0.1 22482.8 Chuẩn 3 0.2 51026.7 Chuẩn 4 0.3 79625 Chuẩn 5 0.4 98155.7
53
Hình 3.22 Hình ảnh bán định lượng hoa, cuộng, lá của các mẫu KN1, KN2, KN3, KN4
Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic:
Trong đó: y: diện tích pic.
x: nồng độ chuẩn Acid Chlorogenic (mg/ml). Chỉ số sdv = 3.20.
Hình 3.23 Hình ảnh bán định lượng hoa, cuộng, lá của các mẫu KN5, KN6, KN7
Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic:
Trong đó: y: diện tích pic.
x: nồng độ chuẩn Acid Chlorogenic (mg/ml). Chỉ số sdv = 2.40.
Nhận xét: với giá trị sdv = 3.20 và 2.40 < 5% , nhận thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ acid chlorogenic và diện tích pic sắc ký.
54
Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Về đặc điểm thực vật và đa dạng sinh học.
Tại Việt Nam theo các công bố của các tác giả Võ Văn Chi ( 2004) và Đỗ Tất Lợi (2004) tại Việt Nam có khoảng 10 loài kim ngân bao gồm các loài Kim ngân hoa to, Kim ngân lông (Lonicera macrantha (D. Don) Spreng.), Kim ngân hoa, Nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb.), Kim ngân lá to (Lonicera hildebrandia Coll. et Hemsl.), Kim ngân lông (Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy ), Kim ngân mốc (Lonicera hypoglauca Miq.), Kim ngân nhẵn , Kim ngân dại (Lonicera dasystyla
Rehd.), Kim ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall. in Roxb.), Kim ngân rối (Lonicera confusa DC.), Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl.), Kim ngân trung bộ (Lonicera annamensis Fukuoka).
Nghiên cứu này, với giới hạn phạm vi thu mẫu ở miền Bắc, đã phát hiện 4 loài đã được phát hiện ở Việt Nam, gồm: Lonicera confusa DC. (KN1); Lonicera dasystyla
Rehder (KN2); Lonicera macratha (D.Don) Spreng. (KN6) và Lonicera japonica
Thunb. (KN5), trong đó có 4 loài đầu mọc hoang và 1 loài được trồng từ nguồn giống nhập nội (Lonicera japonica). Điều đáng chú ý là mặc dù Lonicera japonica được nhắc đến ở nhiều sách thuốc ở Việt Nam nhưng đề tài chưa phát hiện mọc hoang. Có 1 loài lần đầu tiên được xác định có ở Việt Nam (Lonicera reticulata Champ.). Có 2 loài chưa được khẳng định tên khoa học, bao gồm: Mẫu KN3 và KN4, trong đó KN3 có đặc điểm hình thái khá giống Lonicera confusa DC. và KN4 có đặc điểm hình thái khá giống Lonicera macratha (D.Don) Spreng. Tuy nhiên, các dữ liệu phân tử và thành phần hóa học cho thấy chúng có khác biệt. Vì vậy, chúng tôi tạm thời chưa khẳng định tên khoa học. Điều này cho thấy, nếu tiếp tục được nghiên cứu, có thể còn phát hiện thêm một số loài Kim ngân mới nữa ở Việt Nam.
4.1.1.Xác định tên khoa học các mẫu nghiên cứu
Các mẫu thu được trong đề tài được mô tả phân tích theo các đặc điểm cơ quan sinh dư ng và cơ quan sinh sản theo phương pháp mô tả chi tiết. Các đặc điểm này được đối chiếu so sánh với các tài liệu thực vật liên quan trong đó chúng tôi ưu tiên tham khảo các khóa phân loại và đặc điểm mô tả trong các tài liệu thực vật mới và tin cậy trong nước. Bên cạnh đó, các tiêu bản còn được so sánh với các tiêu bản lưu
55
trữ tại phòng tiêu bản Đại học Dược Hà Nội (HNIP), phòng tiêu bản đại học quốc gia (HNU) và phòng tiêu bản viện sinh thái và tài nguyên thực vật (HN) và các tiêu bản type, isotype của các loài trong chi Lonicera L. lưu trữ tại phòng tiêu bản trực tuyến Paris, Kew và New York. Trên cơ sở đó, các tên khoa học của các loài thu được xác định trong nghiên cứu là đáng tin cậy.
4.1.2.Đặc điểm cấu tạo giải phẫu
Cấu tạo giải phẫu thân và lá của 7 loài nghiên cứu được mô tả chi tiết trong nghiên cứu cung cấp thêm những thông tin phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa các dược liệu này. Nhìn chung, các loài trong chi Lonicera L. có nhiều đặc điểm đặc trưng giống nhau như biểu bì thân cấu tạo bới một hàng tế bào nhỏ xếp đều đặn, mô mềm vỏ thân gồm 4 đến 5 lớp tế bào hình bầu dục, gỗ cấp 2 gồm mạch gỗ kích thước không đều hình đa giác xếp thành hàng hay bó libe- gỗ giống hình thận, gỗ nằm trên libe nằm dưới ở lá.
Bên cạnh đó, một số đặc điểm về vi phẫu có thể được sử dụng để hỗ trợ nhận biết các loài nghiên cứu về mặt vi học như: mật độ và kích thước lông che chở trên thân, mật độ lông che chở trên phiến và gân lá, hình dạng và đặc điểm lông che chở, lông tiết trên thân và lá. Các đặc điểm khác biệt này tuy không đủ cơ sở để phân biệt các loài nhưng góp phần bổ sung những dữ liệu kết hợp với các chỉ tiêu về hình thái giúp phân biệt các loài trong chi Lonicera L.
4.2. Về đa dạng di truyền
4.2.1.Trình tự ADN ribosom vùng ITS
Tổng cộng đã thu được 16 đoạn trình tự trong nghiên cứu và sau khi xử lý đã thu được 650 Nucleotid khớp hai chiều và các đoạn gen bảo thủ cho chi Lonicera
L.. Các mẫu nghiên cứu được khuếch đại bằng các cặp mồi đặc trưng và cho kết quả rất tốt. Riêng mẫu KN5 đã tìm được cặp mồi và chu trình thích hợp để khuếch đại gen PCR nhưng khi giải trình tự gen lại không thu được kết quả mong muốn. Thất bại này có thể do quá trình tách thạch và tinh sạch sau quá trình PCR.
56
Hình 4.1 Đoạn gen bảo thủ cho các mẫu nghiên cứu
Sau khi gióng hàng các đoạn gen thu được từ nghiên cứu nhận thấy mẫu KN2 có sự khác biệt lớn nhất so với các mẫu còn lại. Tiếp theo là mẫu KN4.
Hình 4.2 Đoạn gen thể hiện sự khác biệt của KN2 và KN4 với các mẫu còn lại
Sự khác biệt của mẫu KN2 thể hiện ở các Nucleotid số 50, 74,78, 113, 176, 190, 194.... Điều đáng chú ý đây là loài được trồng khá phổ biến ở Việt Nam. Do trình tự ITS khá bảo thủ nên sự khác nhau còn lại có thể là do sự khác nhau dưới loài, cần có thêm những nghiên cứu ở những đoạn ADN mã hóa khác để khẳng định thêm vấn đề này.
4.2.2.Đa dạng di truyền các mẫu Lonicera spp. dựa vào trình tự ADN ribosom vùng ITS. vùng ITS.
Hệ số tương đồng giữa 7 mẫu Lonicera spp. nghiên cứu khá cao đạt 98% hoặc 99%. Vì trình tự vùng ITS khá bảo thủ, nên với sự sai khác một vài nucleotid dẫn đến hệ số tương đồng di truyền giữa 7 mẫu Lonicera spp. là 98% - 99% có thể là sự sai khác dưới loài. Cần có thêm các nghiên cứu trên các đoạn ADN mã hóa khác để khẳng định chắc chắn thêm về sự sai khác dưới loài này. Các dữ liệu trên genbank vẫn chưa đầy đủ và cần có thời gian để xây dựng hoàn chỉnh các dữ liệu này nên không thể xác định một cách chính xác tên khoa học của từng loài trong nghiên cứu.
57
Xây dựng cây phát sinh loài (Neighbor-joining) dựa trên phân tích bootstrap với số lần lặp lại là 1000 lần để kiểm tra tính chính xác và độ tin cậy cho từng nhánh. Kết quả thu được cho thấy mẫu KN2 được tách hẳn ra một nhóm với độ khác biệt với các mẫu còn lại là lớn nhất. Tiếp đó là sự giống nhau giữa hai mẫu KN6 và KN7. Có thể nhận thấy 2 mẫu KN6 và KN7 gần như tương đồng với nhau chỉ khác ở một vài nucleotid điều này có thể giải thích do việc khác nhau giữa khí hậu và địa điểm hai vùng thu hái nên làm biến đổi một vài nucleotid. Tiếp theo cây phân loài chỉ ra một nhóm lớn có sự tương đồng với nhau là nhóm giữa KN1- KN8 và KN3- KN4. Với 2 mẫu KN1 và KN8 có sự tương đồng 100% với nhau điều này khiến chúng tôi thật sự ngạc nghiên. Hai mẫu này được được thu hái ở hai địa điểm hoàn toàn khác nhau nhưng lại có sự tương đồng nhau gần như hoàn toàn. Hai mẫu KN3 và KN4 có sự sai khác nhau ở một số Nucleotid nhưng vẫn khá tương đồng. Như vậy điều kiện về địa lý, thổ như ng, khí hậu,... qua rất nhiều năm có thể ảnh hưởng đến sự đa dạng nguồn gen di truyền. Điều này phù hợp với các công bố trước đây đã chỉ ra rằng ITS là đoạn gen đặc hiệu cho phép phát hiện các sự biến đổi di truyền ở cấp dưới loài, đặc biệt theo các vùng phân bố địa lý.
Kết quả cây phân loại loài dựa vào chỉ thị phân tử khá tương đồng với cây phân loại loài dựa vào đặc điểm hình thái khí chỉ ra các nhóm khác nhau giữa các loài kim ngân nghiên cứu. Các nhóm mẫu nghiên cứu tách biệt nhau khá rõ ràng ở cả 2 cây phân loại. Khác biệt đến từ mẫu KN2 khi đánh giá thực vật nó gần tương đồng với KN1 nhưng khi ở cây phân loài chỉ thị phân tử ITS, mẫu KN2 lại nằm tách biệt hoàn toàn khác biệt hẳn với các mẫu còn lại.
4.3. Về thành phần hóa học
4.3.1.Sắc ký đồ của chi Lonicera spp.
Trong Quan sát hệ sắc kí của 21 mẫu thuộc 7 loài trong chi Lonicera L. dưới bước sóng 254 nm nhận thấy có sự khác biệt nhau rõ rệt về hàm lượng cũng như các vết sắc ki xuất hiện. Bảng 3.6 đã thống kê các vết xuất hiện hoặc không xuất hiện trên sắc kí đồ mỗi mẫu thử hoa, cuộng, lá của các loài nghiên cứu nhận thấy rằng không có sự khác biệt quá lớn giữa các vết xuất hiện ở các mẫu hoa, cuộng, lá trong cùng 1 loài. Ở tất các các mẫu đều có xuất hiện vết tại Rf= 0.44 , 0.68 và 0.84 đây có thể coi là vết sắc kí đặc trưng cho tất cả các mẫu nghiên cứu. Do các mẫu nghiên cứu được chiết theo cùng một quy trình, pha loãng cắn cùng một nồng độ và chấm cùng một thể tích nên việc xuất hiện các vết đậm nhạt hoặc các vết ko xuất hiện cũng là một cơ sở để đánh giá vân tay sắc ki các mẫu. Tiến hành chấm mẫu hoa, lá, cuộng
58
của các loài nghiên cứu gần với nhau để có sự so sánh một cách chính xác. Các mẫu hoa của KN2, KN3, KN6, có xuất hiện các vết tương tự nhau nhưng độ đậm nhạt của các vết rất khác nhau. Riêng với 2 mẫu KN4 và KN5 vết ở vị trí Rf= 0,68 xuất hiện mờ và gần như ko xuất hiện. Nhận thấy rằng có thể do nồng độ chất trong 2 mẫu hoa này quá ít dẫn đến việc ko phát hiện ra vết. Với 2 mẫu hoa của KN1 và KN7 xuất hiện thêm các vết ở Rf lần lượt là 0,34 và 0,26. Điều này phục vụ rất tốt cho việc đánh giá vân tay sắc kí và phân biệt 2 loài này với các loài khác trong cùng chi
Lonicera L. Tương tự với các mẫu cuộng kim ngân các vết sắc kí xuất hiện cũng rất tương đồng ở các mẫu. Riêng đối với mẫu KN2 và KN5 xuất hiện thêm vết sắc kí tại Rf= 0.56. Thêm một vấn đề nữa trong nhận thấy các mẫu cuộng đều có một điểm chung là vết sắc kí tại Rf= 0.68 đều có nông độ rất thấp, vết sắc kí rất mờ. Điều này tương đồng ở cả 7 mẫu kim ngân nghiên cứu. Những vết sắc kí của các mẫu lá kim ngân nghiên cứu cho nhiều vết nhất. Hầu như các mẫu lá nghiên cứu đều xuất hiện gần hết các vết, và mẫu lá KN2 và KN6 cho ta toàn bộ các về sắc kí ở các Rf nghiên cứu. Tiến hành sử dụng phần mềm Pcord4 với các mẫu nghiên cứu theo bảng 3.6 để tiến hành so sánh sự đồng nhất các vết sắc kí xuất hiện ở các mẫu thu được cây phân tích như hình 3.18, 3.19 và 3.20.
Với hình 3.18 các mẫu được chia thành 3 nhóm: Nhóm 1: Lonicera sp.1 (KN3) và Lonicera japonica Thunb. (KN5), tách biệt hoàn toàn khỏi các nhóm còn lại;