2.4.3.1. Tách chiết ADN
Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kít chiết tách ADN thực vật GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bước sau:
Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày.
Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 350 µl Lysis Buffer A. Lắc vortex 10 – 20 giây để trộn đều hỗn hợp đảm bảo tất cả bột lá được tiếp xúc đều với Lysis Buffer A.
Thêm 50 l Lysis Buffer B và 20 l RNase A.
Ủ ở 650
C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc đảo ống trong lúc ủ.
Thêm 130 l Precipitation Solution và lắc đảo ống 2-3 lần. Ủ trong đá 5 phút.
Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút.
Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 400 l Plant ADN Binding Solution và 400 l ethanol 96% và trộn đều.
Chuyển hỗn hợp dịch trên vào ống spin column được cung cấp sẵn. Ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
Thêm 500 l Wash Buffer I đã được thêm ethanol 96% vào ống spin column. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch nổi. Column được chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới.
Thêm 500 l Wash Buffer II đã được thêm ethanol 96%. Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi. Column chứa ADN được chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới.
Thêm 100 l Elution Buffer để hòa tan ADN, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại column, thu ống eppendorf có chứa ADN đã được hòa tan.
20
2.4.3.2. Khuếch đại ADN (PCR)
Phản ứng PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)/ 1 phản ứng
Nước khử ion vô trùng 4,10 Dung dịch đệm cho Taq ADN polymerase (10X) 1,00 Dung dịch MgCl2 1,00
dNTP (2,5mM) 0,30
Mồi xuôi (10pmol/µl) 0,70 Mồi ngược (10pmol/µl) 0,70 Taq ADN-polymerase (5U/µl) 0,25
ADN khuôn 2,00
Tổng thể tích 10,00 Khởi động nhiệt 950C trong 5 phút.
Tiến hành 38 chu kỳ: + Biến tính: 950
C trong 50 giây. + Bắt cặp: 570C trong 50 giây. + Khuếch đại: 720C trong 50 giây.
Pha tổng hợp cuối cùng: 720C trong 8 phút.
2.4.3.3. Điện di ADN trên gel agarose
Đặt bản gel agarose 1% đã được thêm EB vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1x.
Pha mẫu theo tỷ lệ: 2 µL chỉ thị Dye trộn đều với 2 µL sản phẩm PCR.
Làm tương tự với Ladder.
Chạy điện di với hiệu điện thế 90V trong vòng 30 phút.
Quan sát bản gel dưới ánh sang đèn tử ngoại bước sóng 302 nm.
2.4.3.4. Tinh sạch ADN
Cắt lấy đoạn gel chứa ADN nhỏ nhất và nhẹ nhất có thể, cho vào trong ống 1,5 mL.
Thêm 3 thể tích của Buffer 1 (Gel Binding Buffer) vào 1 thể tích của đoạngel.
Ủ ở 60˚C/ 10 phút. Votex đều 2-3 phút/lần trong thời gian ủ cho gel tan hoàn toàn. Quan sát màu của hỗn hợp.
21
Chuyển hỗn hợp sang ADN binding column tube và ly tâm trong 1 phút với tốc độ 13.000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi, và đặt các cột ADN bindingcolumn với ống thu 2,0 mL.
Thêm 500 µL Buffer 2 vào cột lọc ADN. Ly tâm 1 phút với tốc độ 13.000 vòng/phút. Loại bỏ nước rửa và đặt các cột ADN binding column với ống thu 2,0 mL. (tiến hành bước này 2 lần).
Làm khô bằng cách ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ ethanol. Chuyển cột lọc ADN sang ống 1,5 mL mới.
Thêm 30 µL Buffer 3 vào giữa cột lọc ADN, đợi ít nhất khoảng 1 phút ở nhiệt độ phòng để hòa tan.
Thu lấy ADN đã hòa tan bằng cách ly tâm 1 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút.
Bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ -200C.
2.4.3.5. Giải trình tự ADN.
Các mẫu ADN đã tinh sạch được gửi đến phòng thí nghiệm Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự gen. Phương pháp giải trình tự gen sử dụng bộ kit giải trình tự ADN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (AppliedBiosystems) trên máy giải trình tự ABI 3730x1 ADN Analyzer và máy nhân gen ADN Engine Tetrad 2 Peltie Thermal Cycler (BIO-RAD).
2.4.3.6. So sánh trình tự ADN.
So sánh trình tự gen của mẫu nghiên cứu với các trình tự gen của Lonicera spp. đã công bố trên Genbank bằng công cụ Blast.