Kích dục tố (KDT), thuật ngữ tiếng Anh là gonadotropin hay gonadotropic hormone, là những glycoprotein kích thích sự phát triển tuyến sinh dục (buồng trứng và tinh sào) một cách trực tiếp. Định nghĩa như thế vì có những chất khác có khả năng kích thích tuyến sinh dục phát triển một cách gián tiếp. Những chất như thế không được gọi là kích dục tố [1].
Hai kích dục tố kinh điển:
- FSH (Follicle Stimulating Hormone) là hormon kích thích nang trứng. Hệ quả là cả nang trứng và noãn bào đều phát triển.
- LH (Luteinizing Hormone) là hormon hoàng thể hóa. Chúc năng của LH là gây chín noãn bào và rụng trứng. Sự rụng trứng là hiện tượng nang trứng vỡ để noãn bào thoát ra ngoài, đi vào ống dẫn trứng. Nang trứng vỡ ở lại buồng trứng rồi biến thành thể vàng (Corpus Luteum) vì thế mới có thuật ngữ hoàng thể hóa.
Cả FSH và LH đều có nguồn gốc là tuyến yên. Ngày nay nhờ công nghệ sinh học, đã có FSH và LH nhân tạo, được gọi là những KDT tái tổ hợp (Recombinant Gonadotropins) [1].
Ngoài KDT tự nhiên có nguồn gốc là tuyến yên, còn có các hoạt chất khác cũng được gọi là KDT do tính năng sinh lý của chúng trong các thí nghiệm nội tiết học mặc dù chức năng sinh lý tự nhiên của chúng là duy trì thể vàng. Các hoạt chất đó là HCG (Human Chorionic Gonadotropin) KDT màng đệm người và PMSG (Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin) kích dục tố huyết thanh ngựa chửa. Riêng HMG (Human Menopausal Gonadotropin) kích dục tố của phụ nữ mãn kinh là hỗn hợp của FSH và LH tự nhiên.
Chế phẩm KDT được dùng trong sinh sản nhân tạo cá phổ biến hiện nay là dịch chiết từ tuyến yên cá và HCG. Dịch chiết từ tuyến yên cá (fish pituitary gland extract)
dễ kiếm, có thể tự sản xuất sau khi thu, xử lý và bảo quản tuyến yên từ những cá có tuyến sinh dục phát triển tốt trong ao hồ nuôi (như từ cá Chép, cá Trê, Mè, Trắm). Trở ngại của việc thu thập và sử dụng tuyến yên cá là số lượng hạn chế, hoạt tính không ổn định. HCG là hoạt chất được dùng rất phổ biến trong sinh sản nhân tạo cá hiện nay do sự phong phú về nguồn và sự ổn định của hoạt tính. HCG cần được bảo quản ở nhiệt độ của tủ lạnh [1].
Phương pháp Linpe
Linpe, là phương pháp kích thích cá đẻ mang tên của nhà nghiên cứu Canada là Peter R.E. và nhà khoa học Trung Quốc là Lin Hao- ran (Lâm Hạo Nhiên). Nguyên lý của phương pháp Linpe là dùng GnRH–A kích thích tuyến yên cá tiết ra KDT để KDT nội sinh của cá gây ra phản ứng chín và rụng trứng cũng như sự tiết tinh ở cá đực. Trong phương pháp này người ta tiêm cho cá đồng thời hai hoạt chất: GnRH – A (Gonadotropin Releasing Hormon - Analog , Chất tương tự hormon phóng thích kích dục tố và Antidopamine (Dopamine antagonist, Dopamine blocker) là chất chống lại Dopamin (vì Dopamin là chất ức chế sự tiết KDT).
Ovaprim là biệt dược của Canada (Syndel Laboratories) xuất phát từ phương pháp Linpe. Mỗi mL Ovaprim chứa 20μg sGnRH–A (salmon Gonadotropin Releasing Hormone Analog) và 10 mg Domperidon hòa tan trong Propylen Glycol vừa đủ. Lượng thuốc này đủ để gây chín và rụng trứng 1 kg cá cái hoặc 2 kg cá đực.
Các kỹ thuật viên cho cá sinh sản cũng có thể tự tạo ra hỗn hợp thuốc dựa vào phương pháp Linpe, trong đó chứa GnRH–A dưới dạng LH-RH–A (Luteinizing Hormone RH–A) hay Buserelin (Hoechst–Đức)... còn các Antidopamin có thể là Pimozid, Metoclopramid, Haloperidol...
Linpe là phương pháp gây rụng trứng rất mạnh, thậm chí cả những noãn bào chưa thành thục hoàn toàn. Hệ quả là số trứng rụng rất lớn nhưng tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở không cao. Một nhược điểm khác của phương pháp này là thời gian cá tái thành thục dài hơn so với trường hợp dùng kích dục tố hoặc hormon Steroid. Ưu điểm của việc dùng phương pháp Linpe là giá thành thấp do GnRH là một peptid đơn giản, cấu trúc có 10 amino acid [1].
Các hormon steroid
Có thể gây chín noãn bào cá bằng các hormon Steroid thuộc nhóm Gestagen (C21). Những Gestagen sau đây đã cho kết quả sinh sản tốt trên cá (in vivo) trong liều
tiêm quyết định: Progesteron; 17α–Hydroxyprogesteron; 17α–Hydroxy, 20β– Dihydroprogesteron (17,20 P); Desoxycorticosteron, hoặc muối Acetat của nó (DOCA). Liều dùng các Gestagen trong khoảng 2–15 mg/kg cá cái, trong đó mạnh nhất và có nhiều ưu điểm nhất là 17,20P.
Nhược điểm của các Gestagen khi dùng cho cá là chỉ có tác dụng gây chín. Vì thế, cần sử dụng chúng kèm với các yếu tố gây rụng trứng (KDT, Prostaglandin). Ưu điểm của các steroid là chịu được nhiệt độ cao (đến 100 oC), không bị phân hủy bởi vi khuẩn và nấm, dễ pha chế và định liều [1].
Các hoạt chất kích thích cá sinh sản khác
Ngoài các KDT, phương pháp Linpe và các hormon Steroid, trong các thực nghiệm kích thích cá đẻ có thể dùng các hoạt chất liên quan với Feedback âm tính của hệ thần kinh nội tiết trong trục Hypothalamus – Tuyến yên – Buồng trứng. Đó là các Antiestrogen, Aromatase Inhibitor. Việc nghiên cứu các hoạt chất có liên quan với Feedback để kích thích sự phát triển tuyến sinh dục cá mang ý nghĩa lý thuyết là chính [1].
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tên tiếng Việt: Cá mặt quỷ, cá đá, cá bòng. Tên tiếng Anh: Stonefish.
Tên khoa học: Synanveia verrucosa Bloch & Schneider, 1801.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu:
Từ tháng 10/2013 đến tháng 09/2014
2.1.3 Địa điểm bố trí thí nghiệm:
Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III, 33 Đặng Tất, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu trong đề tài được thể hiện trong sơ đồ khối theo hình 2.1.
Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dụng nghiên cứu
2.2.1. Tình hình khai thác, sử dụng và giá trị dinh dưỡng của cá mặt quỷ
2.2.1.1. Phương pháp thu thập số liệu và công thức ước tính sản lượng khai thác và giá trị của cá mặt quỷ
- Phương pháp thu thập số liệu:
Đặc điểm sinh học sinh sản 1. Thử nghiệm cho đẻ: - Kích thích sinh thái - Sử dụng kích dục tố LHRH _A+DOM 2. theo dõi quá trình phát triển
phôi Nghiên cứu bổ sung một số đặc điểm sinh học sinh
sản, giá trị dinh dưỡng nguồn gen và thí nghiệm sinh sản nhân tạo cá mặt quỷ
Tình hình khai thác, sử dụng và giá trị dưỡng của cá mặt quỷ Điều tra thông tin đại lý Tuyển chọn, thuần hóa & nuôi vỗ cá bố mẹ
Phân tích số liệu, nhân xét, thảo luận, kết luận và đề xuất ý kiến
Nghiên cứu bổ sung một số đặc điểm sinh học sinh sản Thử nghiệm sinh sản nhân tạo Phân tích thành phần sinh hóa trong thịt cá Đặc điểm phân bố
Số liệu thứ cấp: số liệu thông qua các báo cáo khoa học, tạp chí của bộ Nông nghiệp & phát triển Nông thôn, internet, các tài liệu có liên quan tới đề tài này.
Số liệu sơ cấp: Thông tin điều tra các đại lý thu mua và tiêu thụ hải sản: giá bán cá, khối lượng cá, sản lượng. Số liệu điều tra về sản lượng: số liệu sản lượng thu mua được của các đại lý trong mỗi tỉnh được dùng để tính giá trị trung bình cho mỗi đại lý trong tỉnh đó, dùng số liệu này đem nhân với tổng số đại lý của mỗi tỉnh để được sản lượng ước tính thu mua được tại tỉnh đó.
Lựa chọn phương pháp điều tra qua phỏng vấn các đại lý cấp 1 ( những người thu mua trực tiếp từ ngư dân) ở địa phương. Thực hiện điều tra theo danh sách được chọn ngẫu nhiên, sử dụng các bảng câu hỏi được thiết kế sẵn (phụ lục 1).
Kết hợp với thông tin về kinh tế trong bảng kết quả điều tra Ngư dân khai thác và tìm hiểu thông tin tại một số nhà hàng tại địa phương để đánh giá về sản lượng và giá trị kinh tế của cá mặt quỷ (phụ lục 2, 3).
Sản lượng trung bình cho mỗi đại lý được xác định theo công thức: A=
Trong đó:
A là sản lượng trung bình ước tính của mỗi đại lý tại mỗi tỉnh (kg); S1 là tổng sản lượng (kg) của tất cả các đại lý trong mỗi tỉnh đã trả lời câu hỏi;
N1 là tổng số đại lý ở mỗi tỉnh đã trả lời câu hỏi (đại lý); Tổng sản lượng đại lý mỗi tỉnh:
St= A*Nt Trong đó:
St là tổng sản lượng ước tính tại tỉnh đó (kg);
Nt là tổng số đại lý thu mua cá Mặt quỷ tại mỗi tỉnh; Giá trị sản lượng khai thác (triệu đồng):
V = St*0,7 (triệu) Trong đó:
V là giá trị khai thác, tính bằng triệu đồng;
2.2.1.2. Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng trong thịt cá
Mẫu cá phục vụ phân tích: 30 cá thể cá còn sống, khối lượng trung bình 870 ± 157 g/con, chiều dài cơ thể 267 ± 37 mm, được thu gom trực tiếp từ các đại lý tại Khánh Hòa, từ tháng 5/2013-3/2014, được vận chuyển sống về làm mẫu phân tích tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III, Nha Trang, để phân tích.
- Định lượng Protein: Sưử dụng quy trình được quy định trong Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN 4328–1:2007 [16].
- Định lượng lipid: Dùng phương pháp định lượng lipid tổng số theo Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN 4331:2001 [19].
- Định lượng tro: theo Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN 4327:2007 [18]. - Định lượng acid béo: bằng phương pháp Ester hóa và sắc ký khí (GC). - Định lượng acid amin: bằng phương pháp sắc ký khí (GC).
2.2.2. Nghiên cứu bổ sung một số đặc điểm sinh học sinh sản
Tiến hành điều tra phỏng vấn ngư dân lặn tại các tỉnh Quảng Ninh, Phú Yên, Ninh Thuận và Bình Thuận...Thực hiện điều tra theo danh sách lựa chọn ngẫu nhiên, bảng mẫu câu hỏi điều tra được thiết kế sẵn (phụ lục 2).
Thu mẫu
Mẫu được thu định kỳ ở 2 đại lý hải sản Hải Long và Hải Lành tại thành phố Phan Thiết tỉnh Bình Thuận và một số đại lý hải sản tại thành phố Nha Trang tỉnh Khánh Hòa. Mỗi tháng thu mua 20 con cá mặt quỷ còn sống vận chuyển về Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III để tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản
Xử lý mẫu
Mẫu tuyến sinh dục của cá được cắt theo phương pháp của Oie (2000a) như sau: tuyến sinh dục được cố định trong dung dịch Division, loại nước bằng Ethanol sau đó làm sạch bằng xylene. Đúc parafin và cắt mỏng 2 - 4 micron bằng dao cắt hiển vi quang học, sau đó nhuộm bằng Hematocylin và Eosin.
Thu mẫu tuyến sinh dục
Buồng trứng và tinh sào của cá Mặt quỷ được thu và xác định khối lượng bằng cân điện tử có độ chính xác đến 0,01g. Cân cá bằng cân đồng hồ có độ chính xác đến 1g.
2.2.2.1. Phân biệt đực, cái và tỷ lệ đực cái
Căn cứ vào hình thái bên ngoài, quan sát, mô tả các đặc điểm cấu tạo của cá nhằm phân biệt đực, cái.
Giải phẫu cá để xác định đặc điểm hình thái cấu tạo tuyến sinh dục, kết hợp với hình thái bên ngoài để phân biệt đực, cái.
Xác định tỷ lệ đực cái dựa vào kết quả phân biệt, lập bảng so sánh tỷ lệ.
2.2.2.2. Các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục
Phương pháp thông thường để đánh giá giai đoạn thành thục của cá là xác định giai đoạn thành thục của từng cá thể theo bậc thang thành thục trong đó có những đặc điểm khác biệt có thể nhận biết được bằng mắt thường. Bậc thang thành thục cho phép đánh giá nhanh mức độ thành thục và khả năng sinh sản của một lượng lớn cá thể.
Quá trình phát triển tuyến sinh dục cá mặt quỷ ngoài tự nhiên được đánh giá dựa trên cơ sở quan sát hình dạng, kích cỡ, màu sắc tuyến sinh dục và xác định bằng thang thành thục sinh dục 6 bậc của Xakun & Buskaia (1968) [43].
Bảng 2.1 Các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục cá mặt quỷ.
Giai đoạn Mô tả
I Cá còn non chưa thành thục sinh dục
II Tuyến sinh dục có kích thước nhỏ, mắt thường không nhìn thấy được III
Giai đoạn thành thục, bằng mắt thường nhìn thấy những hạt trứng, khối lượng tuyến sinh dục tăng lên rất nhanh, tinh sào có
màu trắng trong, chuyển sang màu hồng nhạt
IV Giai đoạn chín muồi, tuyến sinh dục có kích thước lớn nhất, nhưng khi ấn nhẹ các sản phẩm sinh dục chưa chảy ra.
V
Giai đoạn đẻ trứng. Các sản phẩm sinh dục sẽ chảy ra khi nhấn nhẹ vào bụng cá. Khối lượng tuyến sinh dục từ đầu đến cuối giai
đoạn đẻ trứng giảm đi rất nhanh
VI
Giai đoạn sau khi đẻ. Các sản phẩm sinh dục được giải phóng hết, lỗ sinh dục phồng lên, tuyến sinh dục trong dạng túi mềm nhão.
Ở con cái thường có những trứng nhỏ còn sót lại, ở con đực còn sót lại một ít tinh trùng
2.2.2.3. Kích thước thành thục sinh dục lần đầu
Kích thước thành thục sinh dục lần đầu được xác định cho nhóm cá kích thước nhỏ nhất có tuyến sinh dục phát triển ở giai đoạn III, IV, V chiếm tỷ lệ lớn hơn 50% trong tổng số các cá thể của nhóm. Cỡ của nhóm cá thể khi thành thục sinh dục lần đầu được xác định ở điểm mà tại đó 50% số cá thể đã thành thục.
2.2.2.4. Sức sinh sản
Có thể tính sức sinh sản của cá bằng cách đếm tất cả số trứng có trong buồng trứng, đếm mẫu đại diện.
- Sức sinh sản tuyệt đối được tính bằng công thức : F = (n*G)/g Trong đó:
F: sức sinh sản tuyệt đối.
n: số lượng trứng trong mẫu đại diện. G: trọng lượng buồng trứng.
g: trọng lượng mẫu đại diện
- Sức sinh sản tương đối được tính bằng công thức:
Fa = Số trứng có trong buồng trứng/Trọng lượng thân cá cái
2.2.2.5. Hệ số thành thục
Hệ số thành thục là một trong các chỉ số để dự đoán mùa vụ sinh sản của cá và được xác định theo công thức:
GSI = Wg*100/Wb Trong đó:
GSI: Hệ số thành thục
Wg: Trọng lượng tuyến sinh dục Wb: Tổng trọng lượng cá
2.2.2.6. Đường kính trứng
Trứng ở 3 vị trí đầu, giữa và cuối buồng trứng sẽ được lấy đưa lên kính hiển vi quan sát và đo bằng trắc vi thị kính. Đường kính trứng cá là giá trị trung bình đường kính của 30 trứng ở các vị trí nêu trên.
2.2.3. Thử nghiệm sinh sản nhân tạo cá mặt quỷ
2.2.3.1. Thu gom và thuần hóa cá mặt quỷ
Thu gom: Sau khi đã xác định được vùng phân bố của cá mặt quỷ, liên hệ trực
tiếp với ngư dân và các địa điểm thu gom cá ở địa phương (Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận) để mua cá.
Tiến hành chọn cá dựa vào các đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học sinh sản và phân biệt đực cái. Cá còn sống khỏe mạnh, không bị trầy xước, màu sắc tươi sáng tự nhiên. Thu gom cá có trọng lượng từ 600g trở lên để thuần dưỡng.
Vận chuyển: sau khi tuyển chọn cá kỹ càng, vận chuyển cá bằng 2 cách:
+ Đối với những địa điểm thu mua ở gần Viện nghiên cứu tại thành phố Nha Trang: cá được cho vào thùng xốp có chứa nước biển sạch, cho tăng cường sục khí mini và đưa về nơi nghiên cứu.
+ Đối với những địa điểm thu mua ở xa (thành phố Phan Rang, Phan Thiết): Sử dụng phương pháp gây mê đối với cá mặt quỷ, sau đó vận chuyển trong thùng xốp được bơm đầy oxy để đảm bảo cho cá sống khi phải di chuyển thời gian dài.
Cá sau khi được vận chuyển về Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, được tắm bằng nước có Oxy già hoặc Oxytetracycline để loại bỏ ký sinh trùng ngoài da và loại bớt mầm bệnh là vi khuẩn.
Thuần hóa đàn cá
+ Cá mặt quỷ sau khi vận chuyển về được nuôi thuần trong bể xi măng hoặc bể composite, diện tích đáy bể là 4 - 6m2 bể có thể tích 4 - 9m3, độ sâu 1m. Sử dụng chất đáy là cát và san hô [5], [11].
+ Định kỳ thay nước 20-30% lượng nước hàng ngày, nước cấp vào được xử lý qua hệ thống lọc cơ học.
+ Chế độ cho ăn: Trong thời gian 1-2 ngày có mới đem về không cho ăn để cá thích nghi dần với môi trường mới. Những ngày tiếp theo thả cá, tôm sống vào bể để