Nhóm α-amino bậc một trong peptide, protein sẽ phản ứng với o- phthaldialdehyde và β- mercaptoethanol tạo ra một phức chất hấp phụ màu của các nhóm α- và ε-amino là giống nhau không phụ thuộc vào điều kiện môi trường vì các protein bị biến tính trong SDS (sodium dodecyl sulfate) của dung dịch OPA. Phương pháp này cho độ chính xác cao. Vì vậy sản phẩm thủy phân cho tác dụng với OPA và đo bước sóng 340 nm, cùng với đường chuẩn pepton sẽ cho ta xác định được hàm lượng peptide tổng trong mẫu thủy phân.
3.5.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER) SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER)
Nguyên tắc: Là quá trình dịch chuyển các phân tử tích điện trong điện trường, tốc độ dịch chuyển của các phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước và khối lượng phân tử và thường được thực hiện bằng cách đưa vào một lượng nhỏ lên chất mang là khối gel xốp, dưới tác động của hiệu điện thế các phân tử khác nhau của hỗn hợp sẽ chuyển động qua khối gel xốp với vận tốc khác nhau và sẽ có vị trí dưới các dạng băng khác nhau, xuất hiện khi nhuộm gel bằng thuốc hiện màu Coomassie Brilliant blue - R250. Dựa theo protein marker sẽ biết được khối lượng phân tử của peptide protein mình cần biết [13].
Hóa chất và dụng cụ:
Đệm gel tách 1,5M Tris-HCl, pH = 8,8 Đệm gel cô 1,5M Tris-HCl, pH = 6,8 20% SDS 10% ADS TEMED Đệm chạy: 1x 25M Tris; 192 mM glicine; 0,1% SDS; pH = 8,3 Đệm mẫu: 5x 50mM Tris-HCl; pH = 6,8; 2% SDS; 6% glycerol; 1% mercaptoethanol; 0,02% bromophenol Blue.
Các dung dịch nhuộm Colliodal coomassie.
Dung dịch nhuộm (B): 0,1% coomassie Brilliant Blue. Dung dịch tẩy (C): 20% ethanol.
Chuẩn bị dung dịch và đúc gel
Bảng 3.1: Thành phần gel điện di Thành phần gel điện di Gel tách 15% H2O 1,88 ml Gel cô 5% H2O 3,13 ml 40% Acrylamide/bis stock 1,88 ml 40% Acrylamide/bis stock 0,62 ml 1,5 M Tris, pH = 8,8 1,25 ml 1,5 M Tris, pH = 6,8 1,25 ml 10% APS 50µl 10% APS 50µl TEMED 5µl TEMED 5µl Tổng thể tích 5 ml Tổng thể tích 5 ml - Chuẩn bị mẫu điện di
+ Tính toán lượng mẫu thích hợp đảm bảo 10-20µg protein/giếng đối với nhuộm colliodal coomassie và 1-2µg protein/giếng đối với nhuộm bạc + Trộn thể tích nhất định mẫu với đệm mẫu theo tỷ lệ 4:1
+ Ủ ở 950
C trong 5 phút - Điện di
+ Tháo bản kính chứa gel ra khỏi khuôn đổ gel và lắp vào máy điện di + Đổ đệm chạy vào máy
+ Rút lược khỏi bản gel
+ Dùng pipet 200µl rửa các giếng
+ Tiến hành nạp mẫu theo thứ tự vào các giếng trên bản gel + Kết nối máy điện di với nguồn điện di
+ Đặt chế độ chạy: 1mA/giếng cho tới khi vạch chỉ thị màu đi vào gel tách + 2mA/giếng cho tới khi vạch chỉ thị màu chạy tới đáy bản gel
- Nhuộm gel
+ Sau khi chạy, bản kính được tháo ra khỏi máy điện di + Tách lấy gel ra khỏi hai bản kính đặt vào khay nhuộm
- Nhuộm colliodal coomassie
+ Cố định gel trong dung dịch A 30 phút, lắc 30 phút (70 vòng/phút) + Rửa bản gel hai lần bằng nước, mỗi lần 5 phút
+ Nhuộm gel bằng dung dịch B trong ít nhất 1 giờ
+ Rửa gel bằng dung dịch C cho đến khi băng protein xuất hiện rõ ràng, chất màu được loại khỏi nền bản gel, có thể thay dung dịch C nhiều lần.