Cơ sở của phương pháp: Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân cazein bằng enzyme nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng TCA. Định lượng sản phẩm tạo thành bằng cách đo độ hấp thụ của acid amin có trong dung dịch thuỷ phân tại bước sóng 275 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzyme xúc tác tạo ra.
Một đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme làm giải phóng ra 1mg tyrozin trong thời gian 5 phút ở 500
C [13].
Tiến hành
Chuẩn bị dung dịch cazein 2%, pH = 7: Cân chính xác 1g cazein cho vào cốc thuỷ tinh sạch. Thêm 40 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, rồi để cốc trong tủ lạnh 40C ngâm qua đêm để cazein trương nở. Đậy kín bằng giấy bạc để tránh nhiễm khuẩn. Lấy cốc ra, bổ sung vào đó 5 ml dung dịch NaOH 0,1N rồi bổ sung thêm dung dịch đệm để đạt pH = 7. Cốc phải được đặt trên máy khuấy từ để cazein được hoà tan hoàn toàn. Định mức đến 50 ml bằng dung dịch đệm. Như vậy ta sẽ thu được dung dịch cazein 2% pH = 7.
Chuẩn bị dung dịch enzyme:
Đối với chế phẩm enzyme Flavourzyme: Cân 0,1g enzyme, cho vào cốc thuỷ tinh sạch rồi bổ sung 49,9 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, cho lên máy khuấy từ khuấy đều. Được dung dịch enzyme flavourzyme 0,2% (w/v).
Đối với chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L: Tiến hành pha loãng 500 lần bằng dung dịch đệm photphat pH = 7.
Thực hiện phản ứng enzyme: Lấy vào ống falcon 50 ml những thành phần sau: 3,5 ml dung dịch đệm photphat (pH = 7) + 0,5 ml dung dịch cazein 2% (pH = 7) + 0,5 ml dung dịch enzyme vừa chuẩn bị ở trên. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút, sau đó bổ sung 0,5 ml TCA 1,5 M. Giữ trong 30 phút ở 40C để bất hoạt enzym. Sau đó mang đi ly tâm lạnh ở 40
C trong 15 phút với vận tốc 10000 vòng phút. Ta sẽ thu được dịch trong đem so màu ở bước sóng bằng 275 nm sử dụng cuvet thạch anh.
Với mẫu kiểm chứng ta cũng làm tương tự như trên nhưng không để phản ứng 5 phút trong bình ổn nhiệt mà bổ sung TCA vào ngay.
Từ giá trị OD thu được ta tiến hành tính hoạt độ enzyme.