thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Xác định tỷ lệ nấm men chết bằng phương pháp theo dõi vi trường
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu [13].
Cách nhuộm:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40)
3.5.2. Xác định hoạt độ protease (theo phương pháp Anson cải tiến)
Cơ sở của phương pháp: Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân cazein bằng enzyme nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng TCA. Định lượng sản phẩm tạo thành bằng cách đo độ hấp thụ của acid amin có trong dung dịch thuỷ phân tại bước sóng 275 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzyme xúc tác tạo ra.
Một đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme làm giải phóng ra 1mg tyrozin trong thời gian 5 phút ở 500
C [13].
Tiến hành
Chuẩn bị dung dịch cazein 2%, pH = 7: Cân chính xác 1g cazein cho vào cốc thuỷ tinh sạch. Thêm 40 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, rồi để cốc trong tủ lạnh 40C ngâm qua đêm để cazein trương nở. Đậy kín bằng giấy bạc để tránh nhiễm khuẩn. Lấy cốc ra, bổ sung vào đó 5 ml dung dịch NaOH 0,1N rồi bổ sung thêm dung dịch đệm để đạt pH = 7. Cốc phải được đặt trên máy khuấy từ để cazein được hoà tan hoàn toàn. Định mức đến 50 ml bằng dung dịch đệm. Như vậy ta sẽ thu được dung dịch cazein 2% pH = 7.
Chuẩn bị dung dịch enzyme:
Đối với chế phẩm enzyme Flavourzyme: Cân 0,1g enzyme, cho vào cốc thuỷ tinh sạch rồi bổ sung 49,9 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, cho lên máy khuấy từ khuấy đều. Được dung dịch enzyme flavourzyme 0,2% (w/v).
Đối với chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L: Tiến hành pha loãng 500 lần bằng dung dịch đệm photphat pH = 7.
Thực hiện phản ứng enzyme: Lấy vào ống falcon 50 ml những thành phần sau: 3,5 ml dung dịch đệm photphat (pH = 7) + 0,5 ml dung dịch cazein 2% (pH = 7) + 0,5 ml dung dịch enzyme vừa chuẩn bị ở trên. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút, sau đó bổ sung 0,5 ml TCA 1,5 M. Giữ trong 30 phút ở 40C để bất hoạt enzym. Sau đó mang đi ly tâm lạnh ở 40
C trong 15 phút với vận tốc 10000 vòng phút. Ta sẽ thu được dịch trong đem so màu ở bước sóng bằng 275 nm sử dụng cuvet thạch anh.
Với mẫu kiểm chứng ta cũng làm tương tự như trên nhưng không để phản ứng 5 phút trong bình ổn nhiệt mà bổ sung TCA vào ngay.
Từ giá trị OD thu được ta tiến hành tính hoạt độ enzyme.
3.5.3. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng acid amin
- Nguyên tắc: Khi đun nóng ở nhiệt độ cao, acid amin phản ứng với thuốc thử ninhydrin tạo thành 1 phức có màu tím xanh. Dựa vào cường độ màu của phức này khi đo OD ở bước sóng 570nm có thể định lượng được acid amin thông qua xây dựng 1 đường chuẩn [13].
- Tiến hành:
+ Chuẩn bị dịch trong: Dung dịch cần lấy mẫu trước khi lấy mẫu phải lắc đều, sau đó lấy ra 2 g, thêm vào 20 ml nước cất. Đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch trong để lấy mẫu phản ứng.
+ Thực hiện phản ứng ninhydrin: Lấy 1 ml dịch trong thu được ở trên + 1 ml dung dịch ninhydrin 2% + 1 ml dung dịch pyridine 20%, lắc đều. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 750C trong 10 phút. Sau đó, lấy ra làm lạnh trong 20 phút để ổn định màu và dừng phản ứng. Pyridine có vai trò là chất ổn định màu.
Song song với mẫu thí nghiệm ta cũng làm 1 mẫu kiểm chứng tương tự như trên, chỉ khác là thay 1 ml dung dịch cần phân tích bằng 1 ml nước cất.
+ Tiến hành pha loãng: Các mẫu phản ứng sau khi làm lạnh đem đổ vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch, lắc đều.
+ Tiến hành đo quang: Đo quang ở bước sóng 570 nm. Từ giá trị OD thu được ta tính lượng acid amin tạo ra từ 100 g men KTĐ.
3.5.4. Xác định hàm lượng peptide tổng bằng OPA
Nhóm α-amino bậc một trong peptide, protein sẽ phản ứng với o- phthaldialdehyde và β- mercaptoethanol tạo ra một phức chất hấp phụ màu của các nhóm α- và ε-amino là giống nhau không phụ thuộc vào điều kiện môi trường vì các protein bị biến tính trong SDS (sodium dodecyl sulfate) của dung dịch OPA. Phương pháp này cho độ chính xác cao. Vì vậy sản phẩm thủy phân cho tác dụng với OPA và đo bước sóng 340 nm, cùng với đường chuẩn pepton sẽ cho ta xác định được hàm lượng peptide tổng trong mẫu thủy phân.
3.5.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER) SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER)
Nguyên tắc: Là quá trình dịch chuyển các phân tử tích điện trong điện trường, tốc độ dịch chuyển của các phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước và khối lượng phân tử và thường được thực hiện bằng cách đưa vào một lượng nhỏ lên chất mang là khối gel xốp, dưới tác động của hiệu điện thế các phân tử khác nhau của hỗn hợp sẽ chuyển động qua khối gel xốp với vận tốc khác nhau và sẽ có vị trí dưới các dạng băng khác nhau, xuất hiện khi nhuộm gel bằng thuốc hiện màu Coomassie Brilliant blue - R250. Dựa theo protein marker sẽ biết được khối lượng phân tử của peptide protein mình cần biết [13].
Hóa chất và dụng cụ:
Đệm gel tách 1,5M Tris-HCl, pH = 8,8 Đệm gel cô 1,5M Tris-HCl, pH = 6,8 20% SDS 10% ADS TEMED Đệm chạy: 1x 25M Tris; 192 mM glicine; 0,1% SDS; pH = 8,3 Đệm mẫu: 5x 50mM Tris-HCl; pH = 6,8; 2% SDS; 6% glycerol; 1% mercaptoethanol; 0,02% bromophenol Blue.
Các dung dịch nhuộm Colliodal coomassie.
Dung dịch nhuộm (B): 0,1% coomassie Brilliant Blue. Dung dịch tẩy (C): 20% ethanol.
Chuẩn bị dung dịch và đúc gel
Bảng 3.1: Thành phần gel điện di Thành phần gel điện di Gel tách 15% H2O 1,88 ml Gel cô 5% H2O 3,13 ml 40% Acrylamide/bis stock 1,88 ml 40% Acrylamide/bis stock 0,62 ml 1,5 M Tris, pH = 8,8 1,25 ml 1,5 M Tris, pH = 6,8 1,25 ml 10% APS 50µl 10% APS 50µl TEMED 5µl TEMED 5µl Tổng thể tích 5 ml Tổng thể tích 5 ml - Chuẩn bị mẫu điện di
+ Tính toán lượng mẫu thích hợp đảm bảo 10-20µg protein/giếng đối với nhuộm colliodal coomassie và 1-2µg protein/giếng đối với nhuộm bạc + Trộn thể tích nhất định mẫu với đệm mẫu theo tỷ lệ 4:1
+ Ủ ở 950
C trong 5 phút - Điện di
+ Tháo bản kính chứa gel ra khỏi khuôn đổ gel và lắp vào máy điện di + Đổ đệm chạy vào máy
+ Rút lược khỏi bản gel
+ Dùng pipet 200µl rửa các giếng
+ Tiến hành nạp mẫu theo thứ tự vào các giếng trên bản gel + Kết nối máy điện di với nguồn điện di
+ Đặt chế độ chạy: 1mA/giếng cho tới khi vạch chỉ thị màu đi vào gel tách + 2mA/giếng cho tới khi vạch chỉ thị màu chạy tới đáy bản gel
- Nhuộm gel
+ Sau khi chạy, bản kính được tháo ra khỏi máy điện di + Tách lấy gel ra khỏi hai bản kính đặt vào khay nhuộm
- Nhuộm colliodal coomassie
+ Cố định gel trong dung dịch A 30 phút, lắc 30 phút (70 vòng/phút) + Rửa bản gel hai lần bằng nước, mỗi lần 5 phút
+ Nhuộm gel bằng dung dịch B trong ít nhất 1 giờ
+ Rửa gel bằng dung dịch C cho đến khi băng protein xuất hiện rõ ràng, chất màu được loại khỏi nền bản gel, có thể thay dung dịch C nhiều lần.
3.5.6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp β-carotene/ Linoleate (Shaikhan et al, 1995). (Shaikhan et al, 1995).
3.5.7. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá chất lượng bã nấm men bia
Tạo ra được sản phẩm có chất lượng tốt là mục đích quan trọng của mọi quy trình sản xuất. Nhưng để có chất lượng sản phẩm tốt thì yếu tố đầu tiên không thể thiếu là chất lượng của nguyên liệu ban đầu. Do vậy việc đánh giá chất lượng của nguyên liệu dùng để tiến hành thí nghiệm là rất cần thiết.
Sau khi lấy bã nấm men bia dư thừa từ sau quá trình lên men chính được thu nhận tại công ty đem đi xử lý. Chúng tôi tiến hành xác định thành phần chất khô, pH của nguyên liệu, hàm lượng protein tổng số. Các thành phần trong bã nấm men bia sau khi rửa đắng thu được kết quả như bảng 4.1.
Bảng 4.1: Một số thông số cơ bản của bã nấm men bia sau rửa đắng TT Hàm lượng ẩm (%) Hàm lượng protein tổng số (%) Các chất khác (%) pH Mẫu 1 75,11 14,43 10,46 6,58 Mẫu 2 74,64 14,72 10,64 6,53 Mẫu 3 74,81 14,43 10,76 6,52 Trung bình 74,85 14,53 10,62 6,54
Hình 4.1: Biểu đồ thành phần hóa học của bã nấm men bia sau khi rửa đắng
Kết quả bảng trên cho thấy. Sau khi rửa đắng hàm lượng ẩm của nấm men bia là khá cao 74,85%, hàm lượng protein tổng số chiếm khoảng 14,53%, hàm lượng các chất khác trung bình là 10,62%, pH của nấm men sau khi lọc cũng khá trung tính (6,54). Như vậy, nguyên liệu nấm men sau khi xử lý có chất lượng đảm bảo và tiếp tục được đem đi xử lý trong bước diệt men tiếp theo.
4.2. Xác định tỷ lệ nấm men chết
Quá trình diệt men được thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau và trong những khoảng thời gian khác nhau. Kết quả diệt men được thể hiện trong bảng 4.2.
Bảng 4.2: Tỷ lệ chết của tế bào nấm men ở các nhiệt độ khác nhau
Ở 45-500C là khoảng nhiệt mà các tế bào nấm men bị yếu đi do ở khoảng nhiệt độ này một số loại tế bào nấm men ưa nhiệt vẫn phát triển bình thường nên tỷ lệ chết thấp.
TT Nhiệt độ (0C)
Thời gian (phút)
Tỷ lệ chết của tế bào nấm men (%) 1 450C 10 0 15 5 20 16 2 500C 10 30 15 50 20 55 3 550C 10 56 15 73 20 87 4 600C 10 90 15 93 20 95 5 650C 10 97 15 100 20 100
Ở nhiệt độ từ 55-600
C đại bộ phận các tế bào nấm men ưa nhiệt bị ngừng lại. Do vậy tỷ lệ chết của các tế bào nấm men bị chết rõ rệt hơn so với khoảng nhiệt từ 45-500
C.
Đặc biệt khi nhiệt độ tăng lên 650C thì hoạt động của các tế bào nấm men bị ức chế gần như hoàn toàn.
Ngoài nhiệt độ thì thời gian cũng là yếu tố bị ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ chết của tế bào nấm men. Khi thời gian càng dài thì tỷ lệ chết của tế bào nấm men cũng tăng nhưng tỷ lệ tăng không đáng kể.
Như vậy, qua kết quả bảng trên cho thấy tỷ lệ chết của các tế bảo nấm men ở các nhiệt độ khác nhau có sự biến động lớn. Ở nhiệt độ 650C thời gian 15 phút thì tỷ lệ chết của tế bào nấm men là tối ưu nhất.
Tế bào nấm men sống Tế bào nấm men chết
Hình 4.2: Hình ảnh vi trường kiểm tra tỷ lệ chết của nấm men 4.3. Xác định hoạt độ enzyme protease
4.3.1. Xây dựng đường chuẩn tyzosine
Bảng 4.3: Đường chuẩn tyrosine Nồng độ
tyrosine 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Hình 4.3: Đồ thị đường chuẩn tyrosine
Dựa vào phương trình đường chuẩn tyrosine y = 1,279x + 0,004 R2 = 0,998
y là giá trị OD đo được tại bước sóng λ = 275 nm. x là nồng độ tyrosine tính theo mg/ml
Đối với chế phẩm enzyme Flavourzyme: Hoạt độ enzyme Flavourzyme
* 5 * 5 0 5 0 0 0 ( ) 0 , 5 * 0 , 1 X U H d P F x m l = =
5: Số (ml) dịch phản ứng trong ống nghiệm (3,5 ml dung dịch đệm + 0,5 ml dung dịch cazein 2% + 0,5 ml dung dịch enzyme + 0,5 ml dung dịch TCA).
50: Số (ml) dịch enzyme sau khi pha loãng 0,5: Số (ml) dịch enzyme tham gia phản ứng 0,1: Số g) enzyme đem đi pha
Đối với chế phẩm enzyme Neutrase Hoạt độ enzyme Neutrase
* 5 * 5 0 0 5 0 0 0 ( ) 0 , 5 X U H d P N x m l = =
5: Số ml dịch phản ứng trong ống nghiệm (3,5 ml dung dịch đệm + 0,5 ml dung dịch cazein 2% + 0,5 ml dung dịch enzyme + 0,5 ml dung dịch TCA).
500: Số lần pha loãng của dung dịch enzyme 0,5: Số (ml) dịch enzyme tham gia phản ứng
4.3.2. Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Flavourzyme
Để xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Flavourzyme, ta tiến hành pha dung dịch enzyme Flavourzyme 0,2% (w/v). Thực hiện phản ứng enzyme và đo quang ở bước sóng 275 nm. Giá trị OD đo được là 0,088 A.
Hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Flavourzyme là 165,31U/g (công thức tính mục 3.5.2).
4.3.3. Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Neutrase 0,8L
Để xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Neutrase 0,8L, tiến hành pha loãng chế phẩm enzyme 500 lần. Sau đó, thực hiện phản ứng enzyme và đo quang ở bước sóng 275 nm. Giá trị OD đo được là 0,104 A.
Hoạt độ protease trong chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L là 461,52U/ml (công thức tính mục 3.5.2).
4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme bằng chế phẩm enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme
4.4.1 Xây dựng đường chuẩn glutamic
Bảng 4.4: Đường chuẩn glutamic
Acid amin 100g/ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Hình 4.4: Đường chuẩn glutamic
Dựa vào phương trình đường chuẩn glutamic: y = 5,84x + 0,354 R2 = 0,998
y là giá trị OD đo được tại bước sóng λ = 570 nm. x là nồng độ axit glutamic tính theo g/100ml
Hàm lượng axit amin (tính theo axit glutamic) quy ra g/100g men KTĐ là:
* 22 30 100 100 3300 100 * * * ( ) 100 2 10 100 w 100 w 100 x x g menKTĐ = = − −
22: Thể tích dịch thuỷ phân lấy ra đã pha loãng (2 g dịch thuỷ phân + 20 ml nước cất)
2: Số g dịch thuỷ phân lấy mẫu
100: Số (ml) dịch trong chứa x (g) axit amin
30: Khối lượng dịch thuỷ phân chuẩn bị lúc đầu (10 g men lọc chân không + 20 g nước cất bổ sung)
10: Số g men lọc chân không đem đi phản ứng thuỷ phân w: Độ ẩm của men lọc chân không
4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả
năng thuỷ phân protein nấm men
Tỷ lệ chế phẩm enzyme bổ sung vào có ảnh hưởng lớn đến khả năng thuỷ phân protein nấm men. Để xác định tỷ lệ enzyme cơ chất thích hợp, ta tiến hành làm 6 mẫu thí nghiệm với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau:
Mẫu 1: Không bổ sung enzyme
Mẫu 2: Bổ sung 0,1% enzyme (0,01 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 3: Bổ sung 0,4% enzyme (0,04 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 4: Bổ sung 0,7% enzyme (0,07 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 5: Bổ sung 1% enzyme (0,1 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 6: Bổ sung 2% enzyme (0,2 g enzyme/10 g nấm men)
Sản phẩm cuối cùng thu được trong phản ứng thuỷ phân protein là các acid amin. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu, khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzyme được xác định qua lượng acid amin tạo thành.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men
Thời gian thủy phân(giờ)
Hàm lượng acid amin (g/100 g bã men KTĐ) Không bổ sung 0,1% enzyme 0,4% enzyme 0,7% enzyme 1% enzyme 2% enzyme 8 28,86 32,75 36,58 38,04 40,61 43,36 16 34,40 39,25 48,43 50,05 60,47 63,0 24 34,83 39,83 49,74 55,34 64,20 65,66 32 40,08 51,73 53,18 57,28 64,88 65,66 40 43,31 55,60 55,60 60,06 65,60 67,0 Quá trình thuỷ phân xảy ra trong điều kiện nhiệt độ 550C, pH = 7 (điều kiện tối ưu được cung cấp bởi hãng sản xuất). Sau 8 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần. Hàm lượng acid amin được xác định theo phương pháp ninhydrin (xem