Ở Việt Nam, peptide có hoạt tính sinh học mới được quan tâm nghiên cứu trong một thập niên gần đây, chủ yếu các đề tài tập trung nghiên cứu từ nguồn peptide của sữa, đậu tương. Đối với nguồn nguyên liệu từ bã men bia còn rất mới mẻ, chủ yếu các công trình nghiên cứu xử lý bã men bia là để sản xuất nước chấm lên men, chế biến men bổ sung vào quá trình lên men, sản xuất thức ăn cho gia súc gia cầm. Dưới đây là một số công trình nghiên cứu về peptide sinh học đã được công bố trong những năm gần đây của nước ta:
Năm 2009, GS.TS. Phan Văn Chi - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam đã nghiên cứu đề tài khảo sát, xác định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics. Đề tài đã khảo sát, xác định định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics. Trên cở sở các kết quả khảo sát, lựa chọn 1-2 peptide/protein có hoạt
tính giảm đau thần kinh (contoxin) để thiết kế biểu hiện. Nghiên cứu các đặc tính và khả năng ứng dụng của 1-2 loại conotoxin tái tổ hợp.
Năm 2009, Quản Lê Hà - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm. Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu đề tài nhánh
“nghiên cứu ứng dụng enzyme vi sinh vật để tổng hợp và thu nhận peptide chức năng kìm hãm enzyme chuyên angiotensin từ sữa”. Đề tài đã thành công trong việc tìm được điều kiện thích hợp để thu dịch thủy phân casein bằng enzyme Flavourzyme, lựa chọn phương pháp lọc dòng ngang phân đoạn ngang qua màng có kích thước 10kDa cho hoạt tính kìm hãm ACE là 85,7%, xác định được trình tự của peptide ức chế ACE đó và lựa chọn phương pháp sấy đông khô để tạo chế phẩm dạng bột cho sản phẩm. Sơ đồ quy trình công nghệ được thể hiện dưới đây:
Hình 2.9: Sơ đồ thu nhận và tinh sạch ACEIPS từ dịch thủy phân casein Lọc qua màng Casein + enzyme Dừng phản ứng ở 850C, 15 phút Lọc qua màng 10kDa Ly tâm 10000v/20 phút
Điện di kiểm tra độ tinh sạch Ly tâm 6000v/phút
Thu phần dịch nổi
Sản phẩm thủy phân chứa peptide
Lọc qua màng 10kDa
Năm 2006, Nguyễn Đại Nghĩa, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, đã thực hiện đề tài: “Bước đầu tận dụng bã men bia để sản xuất nước chấm lên men”. Kết quả thu được quy trình sản xuất nước chấm lên men tối ưu [10].
Năm 2010, Trần Liên Hà - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu đề tài
nhánh“Nghiên cứu tổng hợp và thu nhận peptide chức năng kìm hãm enzyme chuyển hóa angiotensin từ protein đậu tương”. Tác giả đã sử dụng phương pháp thủy phân bằng tổ hợp enzyme của hai chủng Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevisiae, sử dụng phương pháp lọc dòng ngang để thu các peptide có trọng lượng phân tử thấp và có hoạt tính sinh học thu được là 95%.
Năm 2012, Phạm Quỳnh Trang, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tận dụng phế thải sâu quá trình lên men làm thức ăn chăn nuôi”. Kết quả nghiên cứu đã thu được quy trình xử lý bã nấm men bia và hàm lượng dinh dưỡng sản phẩm thu được thích hợp làm nguồn dinh dưỡng cho gà nuôi [15].
Nhìn chung các tác giả đều sử dụng các phương pháp thông dụng: Thủy phân bằng chế phẩm enzyme thương phẩm, enzyme từ vi sinh vật và tinh sạch peptide. Các quy trình thủy phân, tinh sạch và sản xuất thử nghiệm đều mới thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.Chưa thấy có công trình nào công bố ở Việt Nam nghiên cứu về peptide có hoạt tính chống oxi hóa được thủy phân bằng protease từ bã nấm men bia.
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Bã nấm men bia Saccharomyce Cerevisiae là phần nấm men dư thừa lấy sau quá trình lên men chính được thu nhận tại Công ty Cổ phần Bia Kim Bài - Hà Nội, thị trấn Kim Bài, Thanh Oai, Hà Nội. Nấm men bia được sử dụng là đối tượng nghiên cứu tìm ra những điều kiện tối ưu trong quá trình tách đắng bã nấm men bia để sản phẩm sau quá trình đạt chất lượng tốt phục vụ cho người tiêu dùng.
Phạm vi nghiên cứu: Các peptide có hoạt tính chống oxi hóa.
3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Một số hóa chất của phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Hà Nội:
BSA; Albumin 1mg/ml; Comassie brilliant blue; Ethanol 99%; Acid phosphoric 85%.; Na2CO3.2H2O; Casein 2%; TCA; NaOH; HCl; Tyrosine; 30% acrylamide/bis (29:1); Tris-HCl; 20% SDS; 10% ADS; TEMED; Ammonium persulfate.
Dụng cụ và thiết bị:
Pipetman các loại (0,5-10µl; 10-100µl; 100-1000µl) Đầu típ các loại (0,5-10µl; 10-100µl; 100-1000µl) Cân phân tích 4 số (Precisa)
Máy đo quang phổ kế (HP 8453 - Aglient)
Kính hiển vi Olympus có camera kết nối máy tính Tủ sấy Sanyo (Nhật Bản)
Nồi hấp Tomy SS325 (Nhật Bản) Máy đo pH (Thermo)
Bồn ủ nhiệt (Memmert)
Thiết bị hút chân không (Laboport)
Thiết bị sắc ký tinh sạch protein (Biologic Duoflow - Bio-rad) Thiết bị điện di đứng (Mini Protean 3 cell - Bio-rad)
3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
3.3.1. Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Hà Nội Địa chỉ: Khu nhà A4, Đền Lừ 2, Hoàng Mai, Hà Nội
3.3.2.Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực tập từ 12/2013 đến 5/2014.
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Đánh giá chất lượng bã nấm men bia 3.4.2. Xác định tỷ lệ nấm men chết 3.4.2. Xác định tỷ lệ nấm men chết 3.4.2. Xác định tỷ lệ nấm men chết
3.4.3. Xác định hoạt độ enzyme protease
- Xây dựng đường chuẩn tyzosine
- Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Flavourzyme - Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Neutrase 0,8L
3.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme bằng chế phẩm enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme
- Xây dựng đường chuẩn glutamic
- Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men
- Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men
- So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzyme Neutrase với chế phẩm enzyme Flavourzyme
3.4.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) SDS (SDS-PAGE)
3.4.6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng 3.4.7. Viết sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease 3.4.7. Viết sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease 3.4.7. Viết sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Xác định tỷ lệ nấm men chết bằng phương pháp theo dõi vi trường
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu [13].
Cách nhuộm:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40)
3.5.2. Xác định hoạt độ protease (theo phương pháp Anson cải tiến)
Cơ sở của phương pháp: Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân cazein bằng enzyme nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng TCA. Định lượng sản phẩm tạo thành bằng cách đo độ hấp thụ của acid amin có trong dung dịch thuỷ phân tại bước sóng 275 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzyme xúc tác tạo ra.
Một đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme làm giải phóng ra 1mg tyrozin trong thời gian 5 phút ở 500
C [13].
Tiến hành
Chuẩn bị dung dịch cazein 2%, pH = 7: Cân chính xác 1g cazein cho vào cốc thuỷ tinh sạch. Thêm 40 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, rồi để cốc trong tủ lạnh 40C ngâm qua đêm để cazein trương nở. Đậy kín bằng giấy bạc để tránh nhiễm khuẩn. Lấy cốc ra, bổ sung vào đó 5 ml dung dịch NaOH 0,1N rồi bổ sung thêm dung dịch đệm để đạt pH = 7. Cốc phải được đặt trên máy khuấy từ để cazein được hoà tan hoàn toàn. Định mức đến 50 ml bằng dung dịch đệm. Như vậy ta sẽ thu được dung dịch cazein 2% pH = 7.
Chuẩn bị dung dịch enzyme:
Đối với chế phẩm enzyme Flavourzyme: Cân 0,1g enzyme, cho vào cốc thuỷ tinh sạch rồi bổ sung 49,9 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, cho lên máy khuấy từ khuấy đều. Được dung dịch enzyme flavourzyme 0,2% (w/v).
Đối với chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L: Tiến hành pha loãng 500 lần bằng dung dịch đệm photphat pH = 7.
Thực hiện phản ứng enzyme: Lấy vào ống falcon 50 ml những thành phần sau: 3,5 ml dung dịch đệm photphat (pH = 7) + 0,5 ml dung dịch cazein 2% (pH = 7) + 0,5 ml dung dịch enzyme vừa chuẩn bị ở trên. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút, sau đó bổ sung 0,5 ml TCA 1,5 M. Giữ trong 30 phút ở 40C để bất hoạt enzym. Sau đó mang đi ly tâm lạnh ở 40
C trong 15 phút với vận tốc 10000 vòng phút. Ta sẽ thu được dịch trong đem so màu ở bước sóng bằng 275 nm sử dụng cuvet thạch anh.
Với mẫu kiểm chứng ta cũng làm tương tự như trên nhưng không để phản ứng 5 phút trong bình ổn nhiệt mà bổ sung TCA vào ngay.
Từ giá trị OD thu được ta tiến hành tính hoạt độ enzyme.
3.5.3. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng acid amin
- Nguyên tắc: Khi đun nóng ở nhiệt độ cao, acid amin phản ứng với thuốc thử ninhydrin tạo thành 1 phức có màu tím xanh. Dựa vào cường độ màu của phức này khi đo OD ở bước sóng 570nm có thể định lượng được acid amin thông qua xây dựng 1 đường chuẩn [13].
- Tiến hành:
+ Chuẩn bị dịch trong: Dung dịch cần lấy mẫu trước khi lấy mẫu phải lắc đều, sau đó lấy ra 2 g, thêm vào 20 ml nước cất. Đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch trong để lấy mẫu phản ứng.
+ Thực hiện phản ứng ninhydrin: Lấy 1 ml dịch trong thu được ở trên + 1 ml dung dịch ninhydrin 2% + 1 ml dung dịch pyridine 20%, lắc đều. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 750C trong 10 phút. Sau đó, lấy ra làm lạnh trong 20 phút để ổn định màu và dừng phản ứng. Pyridine có vai trò là chất ổn định màu.
Song song với mẫu thí nghiệm ta cũng làm 1 mẫu kiểm chứng tương tự như trên, chỉ khác là thay 1 ml dung dịch cần phân tích bằng 1 ml nước cất.
+ Tiến hành pha loãng: Các mẫu phản ứng sau khi làm lạnh đem đổ vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch, lắc đều.
+ Tiến hành đo quang: Đo quang ở bước sóng 570 nm. Từ giá trị OD thu được ta tính lượng acid amin tạo ra từ 100 g men KTĐ.
3.5.4. Xác định hàm lượng peptide tổng bằng OPA
Nhóm α-amino bậc một trong peptide, protein sẽ phản ứng với o- phthaldialdehyde và β- mercaptoethanol tạo ra một phức chất hấp phụ màu của các nhóm α- và ε-amino là giống nhau không phụ thuộc vào điều kiện môi trường vì các protein bị biến tính trong SDS (sodium dodecyl sulfate) của dung dịch OPA. Phương pháp này cho độ chính xác cao. Vì vậy sản phẩm thủy phân cho tác dụng với OPA và đo bước sóng 340 nm, cùng với đường chuẩn pepton sẽ cho ta xác định được hàm lượng peptide tổng trong mẫu thủy phân.
3.5.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER) SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER)
Nguyên tắc: Là quá trình dịch chuyển các phân tử tích điện trong điện trường, tốc độ dịch chuyển của các phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước và khối lượng phân tử và thường được thực hiện bằng cách đưa vào một lượng nhỏ lên chất mang là khối gel xốp, dưới tác động của hiệu điện thế các phân tử khác nhau của hỗn hợp sẽ chuyển động qua khối gel xốp với vận tốc khác nhau và sẽ có vị trí dưới các dạng băng khác nhau, xuất hiện khi nhuộm gel bằng thuốc hiện màu Coomassie Brilliant blue - R250. Dựa theo protein marker sẽ biết được khối lượng phân tử của peptide protein mình cần biết [13].
Hóa chất và dụng cụ:
Đệm gel tách 1,5M Tris-HCl, pH = 8,8 Đệm gel cô 1,5M Tris-HCl, pH = 6,8 20% SDS 10% ADS TEMED Đệm chạy: 1x 25M Tris; 192 mM glicine; 0,1% SDS; pH = 8,3 Đệm mẫu: 5x 50mM Tris-HCl; pH = 6,8; 2% SDS; 6% glycerol; 1% mercaptoethanol; 0,02% bromophenol Blue.
Các dung dịch nhuộm Colliodal coomassie.
Dung dịch nhuộm (B): 0,1% coomassie Brilliant Blue. Dung dịch tẩy (C): 20% ethanol.
Chuẩn bị dung dịch và đúc gel
Bảng 3.1: Thành phần gel điện di Thành phần gel điện di Gel tách 15% H2O 1,88 ml Gel cô 5% H2O 3,13 ml 40% Acrylamide/bis stock 1,88 ml 40% Acrylamide/bis stock 0,62 ml 1,5 M Tris, pH = 8,8 1,25 ml 1,5 M Tris, pH = 6,8 1,25 ml 10% APS 50µl 10% APS 50µl TEMED 5µl TEMED 5µl Tổng thể tích 5 ml Tổng thể tích 5 ml - Chuẩn bị mẫu điện di
+ Tính toán lượng mẫu thích hợp đảm bảo 10-20µg protein/giếng đối với nhuộm colliodal coomassie và 1-2µg protein/giếng đối với nhuộm bạc + Trộn thể tích nhất định mẫu với đệm mẫu theo tỷ lệ 4:1
+ Ủ ở 950
C trong 5 phút - Điện di
+ Tháo bản kính chứa gel ra khỏi khuôn đổ gel và lắp vào máy điện di + Đổ đệm chạy vào máy
+ Rút lược khỏi bản gel
+ Dùng pipet 200µl rửa các giếng
+ Tiến hành nạp mẫu theo thứ tự vào các giếng trên bản gel + Kết nối máy điện di với nguồn điện di
+ Đặt chế độ chạy: 1mA/giếng cho tới khi vạch chỉ thị màu đi vào gel tách + 2mA/giếng cho tới khi vạch chỉ thị màu chạy tới đáy bản gel
- Nhuộm gel
+ Sau khi chạy, bản kính được tháo ra khỏi máy điện di + Tách lấy gel ra khỏi hai bản kính đặt vào khay nhuộm
- Nhuộm colliodal coomassie
+ Cố định gel trong dung dịch A 30 phút, lắc 30 phút (70 vòng/phút) + Rửa bản gel hai lần bằng nước, mỗi lần 5 phút
+ Nhuộm gel bằng dung dịch B trong ít nhất 1 giờ
+ Rửa gel bằng dung dịch C cho đến khi băng protein xuất hiện rõ ràng, chất màu được loại khỏi nền bản gel, có thể thay dung dịch C nhiều lần.
3.5.6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp β-carotene/ Linoleate (Shaikhan et al, 1995). (Shaikhan et al, 1995).
3.5.7. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá chất lượng bã nấm men bia
Tạo ra được sản phẩm có chất lượng tốt là mục đích quan trọng của mọi quy trình sản xuất. Nhưng để có chất lượng sản phẩm tốt thì yếu tố đầu tiên không thể thiếu là chất lượng của nguyên liệu ban đầu. Do vậy việc đánh giá chất lượng của nguyên liệu dùng để tiến hành thí nghiệm là rất cần thiết.
Sau khi lấy bã nấm men bia dư thừa từ sau quá trình lên men chính được thu nhận tại công ty đem đi xử lý. Chúng tôi tiến hành xác định thành phần chất khô, pH của nguyên liệu, hàm lượng protein tổng số. Các thành phần trong bã nấm men bia sau khi rửa đắng thu được kết quả như bảng 4.1.
Bảng 4.1: Một số thông số cơ bản của bã nấm men bia sau rửa đắng TT Hàm lượng ẩm