Khả năng ở các mức nhiệt độ khác nhau của 39 chủng nấm men được thể hiện ở Bảng 8. Ở mức 40°C, đa số đều phát triển được ngoại trừ Đ-ST2(2), Đ-VL(1) không phát triển được. Ở mức 43°C, có 30 chủng phát triển được. Điều này giúp cho việc lựa chọn một số chủng tiến hành thí nghiệm lên men dịch rỉ đường dễ dàng hơn. Ở mức 45°C, chỉ duy nhất một chủng phát triển được, đó là chủng D-VL(2).
D-CT2 (1) D-CT2 (2) D-CT2 (3) D-CT2 (4) V-CT2 (1) V-CT2 (2) D-ST1 (1) D-ST1 (2) V-ST1 (1) V-ST1 (2) Đ-ST1 (1) Đ-ST1 (2) (a) (b)
Bảng 8. Sự phát triển của các chủng nấm men ở các mức nhiệt độ ủ khác nhau Chủng nấm men Mức nhiệt độ ủ (°C) 30 35 37 40 43 45 Đ-ST1(1) + + + + + - Đ-ST1(2) + + + + + - V-ST1(1) + + + + - - V-ST1(2) + + + + + - D-ST1(1) + + + + + - D-ST1(2) + + + + + - Đ-ST2(1) + + + + + - Đ-ST2(2) + + + - - - V-ST2(1) + + + + + - V-ST2(2) + + + + - - D-ST2(1) + + + + + - D-ST2(2) + + + + + - Đ-HG(1) + + + + + - Đ-HG(2) + + + + - - Đ-HG(3) + + + + - - V-HG(1) + + + + + - V-HG(2) + + + + + - D-HG(1) + + + + + - Đ-VL(1) + + + - - - Đ-VL(2) + + + + - - Đ-VL(3) + + + + + - Đ-VL(4) + + + + + - V-VL(1) + + + + + - V-VL(2) + + + + + - D-VL(1) + + + + - - D-VL(2) + + + + + + D-VL(3) + + + + - - V-CT1(1) + + + + + - V-CT1(2) + + + + + - D-CT1(1) + + + + + - D-CT1(2) + + + + + - D-CT1(3) + + + + + - D-CT1(4) + + + + + - V-CT2(1) + + + + + - V-CT2(2) + + + + + - D-CT2(1) + + + + + - D-CT2(2) + + + + + - D-CT2(3) + + + + + - D-CT2(4) + + + + + -
Hình 11. Khuẩn lạc chủng D-VL(2) sau khi ủ 4 ngày ở nhiệt độ 45°C 4.6. Khả năng lên men ethanol
Bảng 9. Kết quả lên men ở nhiệt độ 30°C
Chủng nấm men Lên men trong dịch rỉ đường
Brix sau lên men pH sau lên men Độ cồn ở 20°C (v/v)
D-CT1(2) 18,97 3.78 2,06cd D-VL(2) 16,90 3.79 2,57c V-HG(2) 12,60 4.78 7,43a V-ST2(1) 12,90 4.79 7,19ab Ð-HG(1) 12,60 4.52 7,64a Ð-HG(2) 13,60 4.71 6,57b Ð-ST1(2) 17,90 3.80 1,89cd Ð-ST2(1) 18,90 3.77 1,32d
Ghi chú: BrixTrước lênmen = 22°, pH Trước lênmen = 5,14. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình 3 lần lặp lại, các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
Kết quả ở Bảng 9 và biểu đồ Hình 12 cho thấy khả năng lên men dịch rỉ đường của 8 chủng nấm men là không đồng nhất. Cụ thể, độ cồn sinh ra do 3 chủng nấm men V-HG(2), V-ST2(1) và Đ-HG(1) lớn hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% so với các chủng còn lại. Vì trong dịch rỉ, lượng đường saccharose chiếm phần trăm tương đối cao nên không thể xét về khả năng lên men glucose hay saccharose mà đánh giá khả năng của lên men của các chủng được. Do đó, việc lên men 8 chủng nấm
D-VL (1) D-VL (2) D-VL (3)
men ở nhiệt độ 30°C được tiến hành để khảo sát, chọn ra những chủng nấm men có khả năng lên men mạnh kết hợp với khả năng chịu nhiệt để tiến hành thí nghiệm với các mức nhiệt độ cao hơn.
2.06 2.57 7.43 7.19 7.64 6.57 1.89 1.32 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 D-CT1(2) D-VL(2) V-HG(2) V-ST2(1) Ð-HG(1) Ð-HG(2) Ð-ST1(2) Ð-ST2(1) Đ ộ c ồn ( % v /v) Chủng nấm men
Hình 12. Biểu đồ độ cồn (ở 20°C) của 8 chủng nấm men ở 30°C Bảng 10. Kết quả lên men ở các mức nhiệt độ
Chủng nấm men
Nhiệt độ lên men (°C)
30 35 37 39 42 Brix sau lên men Độ cồn ở 20°C (%) Brix sau lên men Độ cồn ở 20°C (%) Brix sau lên men Độ cồn ở 20°C (%) Brix sau lên men Độ cồn ở 20°C (%) Brix sau lên men Độ cồn ở 20°C (%) V-HG(2) 12,60 7,43ab 13,4 6,98a 13,2 6,58a 16,0 4,49a 17,5 3,01ab V-ST2(1) 12,90 7,19b 13,2 7,19a 14,1 6,10a 14,4 5,56a 17,5 3,28a Ð-HG(1) 12,60 7,64a 13,6 7,49a 13,5 6,70a 14,6 5,79a 17,6 2,99b
Ghi chú: BrixTrước lên men = 22°, pH Trước lên men = 5,10. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình 3 lần lặp lại, các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
ab a a a ab a a a a b b a a a a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 30°C 35°C 37°C 39°C 42°C Nhiệt độ lên m en Độ cồn ( % v/v) V-HG(2) V-ST2(1) Đ-HG(1)
Hình 13. Biểu đồ độ cồn (ở 20°C) của 3 chủng nấm men ở các mức nhiệt độ
Ghi chú: Ở mỗi mức nhiệt độ, các mẫu tự được phía trên mỗi cột giống nhau thể hiện sự khác biệt không ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.
Theo kết quả lên men ở các mức nhiệt độ (Bảng 10) và biểu đồ Hình 13, ở mức nhiệt độ 30°C, chủng Đ-HG(1) lên men sinh ethanol nồng độ cao nhất là 7,64% trong 3 chủng lên men. Ở những thí nghiệm lên men ở 35, 37 và 39°C thì khả năng lên men của 3 chủng nấm men đồng nhất, khác biệt không ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Riêng thí nghiệm ở 42°C, khả năng lên men của 3 chủng khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, chủng V-ST2(1) lên men mạnh nhất, tiếp đến là chủng V-HG(2), cuối cùng là chủng Đ-HG(1) với nồng độ ethanol lần lượt là 3,28; 3,01 và 2,99% v/v. Từ kết quả trên, có thể khẳng định rằng chủng V-ST2(1) chịu ảnh hưởng của nhiệt độ ít hơn 2 chủng Đ-HG(1) và V-HG(2). Hay nói cách khác, chủng V-ST2(1) có khả năng chịu nhiệt cao hơn 2 chủng còn lại. Nhìn chung, nồng độ ethanol mà 3 chủng nấm men sinh ra giảm khi nhiệt độ lên men tăng dần. Theo Navarro và Durand (1978) khi nhiệt độ tăng cao thì lượng ethanol tích lũy nội bào của tế bào nấm men tăng cao làm ngưng trệ sự phát triển của nấm men. Vì vậy, lượng ethanol sinh ra giảm khi nhiệt độ môi trường tăng.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Phân lập được 39 chủng nấm men. Tất cả các chủng nấm men đều có khả năng lên men đường maltose, có 7 trong tổng số 39 chủng có khả năng lên men đường saccharose, có 1 chủng phân giải urea là D-CT2(2) và 2 chủng có khả năng phân giải gelatine là D-CT2(2) và D-CT1(4). Tất cả đều phát triển được trên môi trường bổ sung 9% ethanol ngoại trừ D-ST2(1) và có 11 chủng phát triển trên môi trường bổ sung 12% ethanol. Ở mức 43°C, có 30 chủng phát triển và có 1 chủng phát triển ở 45°C là D-VL(2).
Thí nghiệm lên men 30°C, kết quả cho thấy có 3 chủng lên men lên men sinh ethanol nồng độ cao là V-ST2(1), V-HG(2) và Đ-HG(1) với các giá trị lần lượt là 7,19%, 7,43% và 7,64%.
Ở những thí nghiệm lên men ở 35, 37 và 39°C, 3 chủng nấm men trên có khả năng lên men đồng nhất. Thí nghiệm ở 42°C, nồng độ ethanol sau lên men của 3 chủng V-ST2(1), V-HG(2) và Đ-HG(1) lần lượt là 3,28; 3,01 và 2,99% v/v. Từ kết quả trên có thể kết luận rằng, chủng V-ST2(1) ít chịu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ nhất trong 3 chủng được lên men.
5.2. Đề nghị
Tiếp tục khảo sát khả năng chịu đựng nồng độ ethanol và nhiệt độ ở các mức cao hơn và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men ở nhiệt độ cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
Bùi Ngọc Hân. 2013. Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ chất bã mía. Luận văn tốt nghiệp Đại học, ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Cần Thơ.
Kiểu Hữu Ảnh. 2012. Giáo trình vi sinh vật học. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật.
Lương Đức Phẩm. 1999. Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp Hà Nội.
Lương Đức phẩm. 2006. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội.
Lương Đức Phẩm. 2009. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội.
Ngô Thị Phương Dung. 2009. Khảo sát khả năng lên men và tính chịu cồn của nấm men. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 11: 374-382. Nguyễn Công Hà. 2000. Bài giảng kỹ thuật lên men rượu bia. Khoa Nông Nghiệp Và
Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng. 2000. Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn ethylic. Nhà Xuất Bản Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội.
Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền và Nguyễn Thị Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm Công nghệ Vi sinh vật tập 2. NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, trang 336.
Nguyễn Đức Lượng. 1996. Công nghệ Vi sinh vật. Thực phẩm lên men truyền thống, Tập 3, Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Thành Phố Hồ chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng. 2004. Cở sở vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Thành Phố Hồ chí Minh.
Nguyễn Vân Anh, Phạm Minh Tú, Hứa hữu Danh, Nguyễn Bình Duy Anh, Huỳnh Xuân Phong và Ngô Thị Phương Dung. 2011. Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol mạnh. Đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên cấp trường, Trường Đại Học Cần Thơ.
Nguyễn Vân Anh. 2011. Tuyển chọn nấm men chiệu nhiệt và chịu cồn ứng dụng trong sản xuất ethanol. Luận văn tốt nghiệp Đại học, ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Trần Liên Hà. 2007. Đại cương vi sinh vật thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội.
Tiếng Anh
Alfenone, S., C. Molina, S.E. Guillouet, J.L. Uribelarrea, G. Goma and L. Benbadis. 2002. Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae
by a vitamin feeding stratrgy during fed-batch process. Applied Microbiology and Biotechnology, 60:67-72.
Arthur, H. and K. Watson. 1976. Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic and thermophilic yeasts. Journal of Bacteriology, 128(1):58-68.
Banat, I. M., P. Nigram, and R. Marchant. 1992. Isolation of thermotolerant, fermentative yeasts growing at 52°C and producing ethanol at 45°C. World J. Microbio 8:259-263.
Barron, N., R. Marchant, L.McHale and A.P McHale and A.P. McHale. 1994. Growth of thermotolerant ethanol-producing strain of Kluyveromyces marxianus on cellobiose-containing media. Biotechnology Letter, 16:625-630.
Brady, D., R. Marchant, L.McHale and A.P McHale and A.P. McHale. 1994. Production of ethanol by thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactose-containing media. Biotechnology Letter, 16:625-630. Casey, G.P. and W. M. Ingledew. 1986. Ethanol tolerance in yeast. Micobiol, 13:219-
280.
D’Amore, T., and Stewart, G. 1987, Ethanol tolerance of yeast, Enzyme and Microbial Technology 9, 322-330
Dung, Ngo Thi Phuong. 2004. Defined fungal starter granules for purple glutinous rice wine, Ph.D. thesis Wageninger University, Wageninger, The Netherlands.
Fleming, M., N. Barron. R. Marchant, McHale and A.P McHale and A.P. McHale. 1993. Studies on the growth of a thermotolerant yeast, Kluyveromyces Marxianus
IMB3 during growth on lactose-containing media. Biotechnology Letter, 16:1195-1198.
Helena da Cruz, S., M. Batistote and J.K. Ernandes. 2003. Effect of sugar catabolite repression in correlation with the structure complexity of nitrogen source on yeast growth and fermentation. Journal of Industrial and Brewing, 109(4):349- 355.
Hiang Chiung-Fang, Lin Ting-Hsiang, Guo Gia-Luen, Hwang Wen-Song. 2009. Enhanced ehtanol production by fermentation of rice straw hydrolysate without detoxification using a newly adapted strain of Pichia stipilis. Bioresource technology, 100:3914-3920.
Ingledew, W.M. 1993. Yeasts for the production of fuel ethanol. The Yeasts. Academic Press, 5:245-291.
Kurtzman, C,P and Piskur. 2009. Taxonomy and phylogenetic diversity among the yeasts. Topics in current genetic, 15:29-46.
Lee, J.H., Wiliamson, D., and Roger, P.L.1980. The effect of temperature on the kinetics of ethanol production by Saccharomyces uvarum. Biotechnology Letter. Lee, J.H., Williamson, D,. and Rogers, P.L. 1980. The effect of temperature on the
kinetics of ethanol production by Saccharomyces uvarum. Biotechnology Letter. Limtong Savitree, Nantana Srisuk, Wichien Youngmanitchai, Hiroya Yurimoto,
Yasuyoshi Sakai and Mamoru Yamada. 2009. Diversity of culturable thermotolerant yeast in Thailand: I, Methylotrophic yeast and II, Ethanol producing yeasts. The 1st joint serminar of Asia program, pp.94-95.
Limtong Savitree, Nantana Srisuk, Wichien Youngmanitchai, Hiroya Yurimoto, Yasuyoshi Sakai and Mamoru Yamaha. 2009. Diversity of culturable thermotolerant yeast in Thailand: I. Methylotrophic yeast and II. Ethanol producing yeasts. The 1st joint serminar of Asia program, pp. 94-95.
McCracken, L.D. and Gong, C.S. 1982. Fermentation of cellulose and hemicelluloses carbonhydrats by thermotolerant yeasts. Biotechnology Bioengineering, 25: 253- 300.
Navaro, J.M and G. Durand. 1978. Alcohol fermentation: effect of temperature on ethanol accumulation within yeast cells. Annals of Microbiology 129B: 215-224
Norr, A.A., A. Hameed, K.P. Bhatti, and S.A.. Tunio. 2003. Bio-ethanol fermentation by the bioconversion of sugar from dates by Saccharomyces cerevisiae strain ASN-3 and HA-4, Biotechnology. 2(1):8-17
Nout, Rob et al., 1999. Food fermentation, Wageninger Agricultual University
Roehr, M .2001. The biotechnology of ethanol. Classical and Future Applications, Chichester: Wiley – VCH, pp,232.
Torija, M,J,, Rozes, N,, Poblet, M,, Guillamon, J,M, and Mas, A. 2003. Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae,
International Journal of Food Microbiology, 80:47–53.
Uneo, R., Hamada-sato, N, and Urano, N. 2003. Fermentation of molasses by several yeasts from hot spring drain and phylogeny of the unique isolate producing ethanol at 55°C. Journal of Tokyo University of Fisheries, 90:23-30
Yamada Mamoru and Akadal Rinji. 2008. High-Temperature Ethanol Fermentation and Transformation with Linear DNA in the Thermotolerant Yeast
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042. Applied and Environmental Microbiology, 74:7514-7521. Website http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%ADa ( ngày 6/12/2014) http://www.diark.org/img/species_pict/Kluyveromyces_marxianus_CBS712(ngày 28/02/2014) http://www.diark.org/img/species_pict/Kluyveromyces_lactis_NRRL_Y_1140(ngày 28/02/2014) http://vi.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae (ngày 6/12/2014) http://suckhoeso.com/uploads/nam%20men%20cadida.gif (ngày 28/02/2014)
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM
Hình 14. Một số thiết bị, máy móc trong phòng thí nghiệm
Kính hiển vi Cân phân tích Brix kế
Máy Vortex Tủ cấy vô trùng
D-CT1(1)
D-CT1(2)
D-CT1(3)
V-CT1(1)
V-CT1(2)
D-CT2(1)
V-CT2(1) D-CT2(3)
D-CT2(4)
Đ-HG(2)
Đ-HG(3) Đ-HG(1)
V-HG(2)
D-HG(1)
D-ST1(1)
Đ-ST1(1)
Đ-ST1(2)
V-ST1(1)
D-ST2(1)
D-ST2(2)
Đ-ST2(1)
V-ST2(1)
V-ST2(2)
D-VL(1)
D-VL(3)
Đ-VL(1)
Đ-VL(2)
Hình 15. Khuẩn lạc và tế bào của 39 chủng NM dưới kính hiển vi (E100)
Đ-VL(4)
V-VL(1)
Hình 16. Kết quả urea dương tính của chủng D-CT2(2)
Hình 17. Kết quả gelatine dương tính (a)-chủng D-CT1(4) và (b)-chủng D-CT2(2)
PHỤ LỤC 2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào nấm men
Khuẩn lạc nấm men
Sử dụng que cấy lấy tế bào nấm men từ ống trữ cho vào 9 mL nước cất đã khử trùng, tiến hành vortex để nấm men phân bố đều. Sau đó, lấy 5 µL dịch nấm men nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường YPD agar, trải đều dịch lên bề mặt đĩa bằng que cấy trải.
auk hi ủ 24-48 giờ, tiến hành quan sát các chỉ tiêu hình thái như: hình dạng, kích thước, màu sắc, dạng bìa và độ nổi của khuẩn lạc nấm men.
Tế bào nấm men
Các bước quan sát tế bào nấm men được tiến hành như sau: - Chuẩn bị mẫu nấm men.
- Nhỏ 10 µL nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy sinh khối nấm men rồi trãi đều lên giọt nước trên kính mang vật.
- Để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o rồi đậy kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học để thấy được hình dạng của tế bào nấm men.
2.2. Phương pháp pha loãng
- Dùng pipet hút 1 mL mẫu cho vào ống pha loãng chứa 9 mL nước cất, sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10 tức 10-1, mẫu này được lắc đều trên máy vortex, và tiếp tục hút 1mL từ ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2 ta có mẫu ở độ pha loãng 10-2, thực hiện tương tự cho đến độ pha loãng mong muốn.