Mục đích: Tách ròng các dòng nấm men có trong các nguồn nguyên liệu mía. Phương pháp tiến hành:
- Mẫu được nuôi tăng sinh trong 50 mL môi trường tăng sinh khối ủ lắc ở nhiệt độ phòng (28-30°C) trong 48 giờ.
- Tiến hành phân lập nấm men trên môi trường phân lập, ủ ở 30°C. Chọn khuẩn lạc rời rạc để cấy chuyển theo cách cấy phân lập đến khi ròng thì trữ trong ống nghiệm để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Sơ đồ thực hiện:
Hình 8. Sơ đồ bố trí phân lập nấm men từ mía 3.2.2. Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa
Đặc điểm hình thái
Mục đích: Xác định hình dạng và kích thước của tế bào nấm men góp phần cho định danh các chủng nấm men đã phân lập.
Phương pháp tiến hành:
Mẫu
Tăng sinh
Cấy lên bề mặt đĩa Petri
Cấy phân lập
Kiểm tra độ ròng
- Cấy ria các chủng nấm men trên môi trường YPD agar.
- Ủ ở 30oC trong 24-48 giờ, ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm men.
- Làm tiêu bản của các chủng nấm men và quan sát dưới kính hiển vi, ghi nhận hình dạng của tế bào nấm men.
Khả năng phân giải urea
Mục đích: Phát hiện các chủng nấm men có enzyme urease. Phương pháp tiến hành
- Chuẩn bị môi trường Chistensen urea broth: thành phần trong 1.000 mL môi trường: Urea 20 g Yeast extract 0,1 g Na2HPO4 9,5 g K2HPO4 9,1 g Phenol red 0,01 g Chỉnh pH đến 6,7 ± 0,2
- Cho môi trường Chistensen Urea Broth vào ống nghiệm (5 mL/ống). - Khử trùng môi trường ở 115oC trong 15 phút, để nguội.
- Chủng các chủng nấm men phân lập được vào các ống môi trường và ủ ở 30oC trong 24-48 giờ. Ghi nhận kết quả.
- Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ thẫm. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Khả năng phân giải gelatine
Mục đích: Xác định khả năng phân giải gelatine của các chủng nấm men phân lập.
Phương pháp tiến hành:
Công thức môi trường chứa gelatine cho 1.000 mL môi trường:
Gelatine 120 g
Peptone 0,2 g
Yeast extract 0,5 g
Chỉnh pH đến 6,7 ± 0,2
- Cho môi trường chứa gelatine vào ống nghiệm (3 mL/ống).
- Khử trùng môi trường chứa gelatine ở 121oC trong 20 phút, để nguội.
- Chủng các chủng nấm men phân lập được vào ống môi trường và ủ ở 30oC trong 48 giờ.
- Sau đó để mẫu vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C trong 24 giờ.
- Kết quả dương tính khi dịch trong ống nghiệm không bị đông đặc. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Khả năng lên men đường maltose
Mục đích: Khảo sát lượng CO2 sinh ra của các chủng nấm men trong quá trình lên men để xác định tốc độ lên men trong môi trường maltose.
Phương pháp tiến hành:
- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men. - Ủ lắc ở nhiệt độ 30° trong 24-48 giờ.
- Chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch đường maltose 2% đã được khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
- Lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong ống Durham.
- Lên men ở nhiệt độ 30°C
- Đo chiều cao cột khí trong ống Durham sau 4 giờ/ lần đến khi chiều cao cột khí đạt 30 mm hoặc đến 48 giờ rồi kết thúc thí nghiệm.
Khả năng lên men đường saccharose
Mục đích: Khảo sát lượng CO2 sinh ra của các chủng nấm men trong quá trình lên men để xác định tốc độ lên men trong môi trường đường saccharose.
Phương pháp tiến hành:
- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men - Ủ lắc ở nhiệt độ 30° trong 24-48 giờ
- Chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch đường saccharose 2% đã được khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
- Lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong ống Durham.
- Lên men ở nhiệt độ 30°C.
- Đo chiều cao cột khí trong ống Durham sau 4 giờ/ lần đến khi chiều cao cột khí đạt 30 mm hoặc đến 48 giờ rồi kết thúc thí nghiệm.
- Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
3.2.3. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men
Mục đích: Khảo sát lượng CO2 sinh ra của các chủng nấm men trong quá trình lên men để xác định tốc độ lên men.
Phương pháp tiến hành:
- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men - Ủ lắc ở nhiệt độ 30° trong 24-48 giờ
- Chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch đường glucose 2% đã được khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
- Lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong ống Durham.
- Lên men ở nhiệt độ 30°C
- Đo chiều cao cột khí trong ống Durham sau 2 giờ/lần đến khi chiều cao cột khí đạt 30 mm hoặc đến 48 giờ rồi kết thúc thí nghiệm.
- Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
- Tuyển chọn các chủng nấm men có hoạt tính lên men mạnh để tiến hành thí nghiệm 3.2.6.
3.2.4. Khảo sát khả năng chịu ethanol
Mục đích: Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển trong môi trường có ethanol.
Phương pháp tiến hành:
- Cấy ria 6 chủng nấm men đã ròng vào đĩa petri chứa môi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết ở các nồng độ khác nhau 0%, 3%, 6%, 9% và 12% v/v. Ethanol được bổ sung trong quá trình đổ môi trường agar vào đĩa.
- Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ ở 30°C từ 1 đến 4 ngày.
- Quan sát sự tạo khuẩn lạc của các chủng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ có các chủng nấm men chịu ethanol mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường có nồng độ ethanol cao.
- Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt, tạo thành khuẩn lạc to, tròn của các chủng nấm men ở điều kiện nồng độ ethanol cao trong thời gian từ 1 đến 4 ngày.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ ethanol cao.
3.2.5. Khảo sát tính chịu nhiệt của các chủng nấm men
Mục đích: Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao.
Phương pháp tiến hành
- Cấy ria 6 chủng nấm men đã ròng vào đĩa petri chứa môi trường phân lập. - Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 35, 37, 40, 43, 45°C trong 1 đến 4 ngày.
- Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men khác nhau trên đĩa thạch. Chỉ có các chủng nấm men chịu nhiệt mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc ở nhiệt độ cao.
- Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to, tròn của các chủng nấm men ở nhiệt độ cao trong thời gian từ 1 đến 4 ngày.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.2.6. Khảo sát khả năng lên men ethanol
Mục đích: Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng lên men mạnh ở nhiệt độ cao.
Phương pháp tiến hành:
- Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường tăng sinh khối ở 30°C đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108 tế bào/mL.
- Cho 99 mL dung dịch rỉ đường ở 22°Brix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
- Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã được nuôi cấy vào các bình tam giác, mật số nấm men sau khi chủng là 106 tế bào/mL.
- Ủ 4-7 ngày trong điều kiện kỵ khí ở các nhiệt độ 30°C, 35°C, 37°C, 39°C và 42°C.
- Sau thời gian ủ, đo pH và độ Brix. Đem chưng cất dịch lên men để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20°C.
- Chỉ tiêu đánh giá: nồng độ ethanol thu được sau lên men, hàm lượng đường sử dụng, hiệu suất lên men.
- Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.7. Phương pháp phân tích
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập nấm men từ các mẫu mía
Qua quá trình phân lập 16 mẫu (đất, vỏ và dịch mía) từ 4 tỉnh Sóc Trăng, Cần Thơ, Vĩnh Long và Hậu Giang, phân lập được 39 chủng nấm men.
Bảng 2. Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu, tên các chủng phân lập
Tên chủng nấm men Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu
V-CT1(1), V-CT1(2) Vỏ mía Cổng C (ĐHCT) Ninh Kiều, Cần Thơ (12 chủng) D-CT1(1), D-CT1(2), D-CT1(3), D-CT1(4) Dịch mía V-CT2(1), V-CT2(2) Vỏ mía Khoa Sư phạm (ĐHCT) D-CT2(1), D-CT2(2), D-CT2(3), D-CT2(4) Dịch mía V-HG(1), V-HG(2) Vỏ mía
Ngã Bảy, Hậu Giang (6 chủng) D-HG(1) Dịch mía Đ-HG(1), Đ-HG(2), Đ-HG(3) Đất trồng mía V-ST1(1), V-ST1(2) Vỏ mía Châu Thành, Sóc Trăng (6 chủng) D-ST1(1), D-ST1(2) Dịch mía Đ-ST1(1), Đ-ST1(2) Đất trồng mía V-ST2(1), V-ST2(2) Vỏ mía Mỹ Tú, Sóc Trăng (6 chủng) D-ST2(1), D-ST2(2) Dịch mía Đ-ST2(1), Đ-ST2(2) Đất trồng mía V-VL(1), V-VL(2) Vỏ mía Long Hồ, Vĩnh Long (9 chủng) D-VL(1), D-VL(2), D-VL(3) Dịch mía Đ-VL(1), Đ-VL(2), Đ-VL(3), Đ-VL(4) Đất trồng mía
Dựa vào Bảng 2 ta thấy, ở địa điểm Cần Thơ đã thu được 4 mẫu mía gồm 2 mẫu vỏ mía và 2 mẫu dịch mía, 2 mẫu được mua từ xe nước mía gần Cổng C trường Đại học Cần Thơ (ĐHCT) và 2 mẫu được mua từ xe nước mía gần Khoa Sư phạm (ĐHCT). Tuy nhiên, 4 mẫu này chỉ gồm vỏ và dịch mía, không đa dạng như ở các địa điểm còn lại có thêm mẫu đất trồng mía. Ở mỗi địa điểm, chủ yếu thu 3 mẫu là vỏ, dịch và đất trồng mía. Rõ ràng ta thấy, ở Ninh Kiều (Cần Thơ) và Long Hồ (Vĩnh Long) là nơi có sự đa dạng về số chủng nấm men phân lập được, ở Ninh Kiều (Cần Thơ) là 12 chủng (4 mẫu) và ở Long Hồ (Vĩnh Long) là 9 chủng (3 mẫu), trong khi đó ở mỗi địa điểm còn lại chỉ phân lập được 6 chủng. Ở mỗi địa điểm, với loại mẫu khác nhau thì sự đa dạng về số chủng phân lập được cũng khác nhau, mẫu dịch mía ở Ninh Kiều (Cần Thơ) phân lập được 4 chủng nấm men trong khi dịch mía ở Ngã Bảy (Hậu Giang) chỉ phân lập được 1 chủng và dịch mía ở Châu Thành (Sóc Trăng) chỉ phân lập được 2 chủng.
Có thể kết luận rằng, sự đa dạng về chủng nấm men phân lập tùy thuộc vào loại mẫu (vỏ, dịch, đất trồng mía) và địa điểm thu mẫu.
4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
4.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào nấm men, khả năng phân giải urea và gelatine năng phân giải urea và gelatine
Bảng 3. Đặc điểm hình thái, khả năng phân giải urea và gelatin của các chủng nấm men Chủng nấm men Hình dạng tế bào Khuẩn lạc năng Khả phân giải gelatine Khả năng phân giải urea Hình dạng Kích thước (mm)
Đ-ST1(1) Oval nhỏ Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,2 - -
Đ-ST1(2) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt trơn láng, màu trắng đục 2,8 - -
V-ST1(1) Elip dài Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,2 - -
V-ST1(2) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa. 3 - -
D-ST1(1) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,3 - -
D-ST1(2) Oval lớn Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng đục 2,4 - -
Đ-ST2(1) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
trơn láng, màu trắng đục 2,9 - -
Đ-ST2(2) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt khô nhăn, màu trắng sữa 2,5 - -
V-ST2(1) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
trơn láng, màu trắng sữa 2,9 - -
V-ST2(2) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,8 - -
D-ST2(1) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,6 - -
D-ST2(2) Elip dài Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 3,1 - -
Đ-HG(1) Oval lớn Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
trơn láng, màu trắng đục 2,3 - -
Đ-HG(2) Oval nhỏ Tròn, bìa răng cưa, lài, bề mặt trơn láng,
màu trắng đục 2,1 - -
Đ-HG(3) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,2 - -
V-HG(1) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,5 - -
V-HG(2) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
D-HG(1) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,8 - -
Đ-VL(1) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt khô nhăn, màu trắng sữa 2,3 - -
Đ-VL(2) Oval lớn Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,1 - -
Đ-VL(3) Elip dài Tròn, bìa nguyên, lài, bề mặt khô nhăn,
màu trắng sữa 2,9 - -
Đ-VL(4) Oval lớn Tròn, bìa răng cưa, lài, bề mặt khô nhăn,
màu trắng ngà. 2,6 - -
V-VL(1) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt khô nhăn, màu trắng sữa 2,6 - -
V-VL(2) Oval nhỏ Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 1,8 - -
D-VL(1) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,6 - -
D-VL(2) Cầu Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt trơn láng, màu trắng đục 2,7 - -
D-VL(3) Elip dài Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,9 - -
V-CT1(1) Cầu Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt khô nhăn, màu trắng sữa 2,6 - -
V-CT1(2) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,9 - -
D-CT1(1) Oval lớn Tròn, bìa nguyên, lài, bề mặt khô nhăn,
màu trắng sữa 2,2 - -
D-CT1(2) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
trơn láng, màu trắng sữa 2,8 - -
D-CT1(3) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,4 - -
D-CT1(4) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
trơn láng, màu trắng đục 2,1 + -
V-CT2(1) Elip dài Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,7 - -
V-CT2(2) Oval nhỏ Tròn, bìa nguyên, lài, bề mặt trơn láng,
màu trắng đục 2,9 - -
D-CT2(1) Oval lớn Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,3 - -
D-CT2(2) Elip dài Tròn, bìa nguyên, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,7 + +
D-CT2(3) Oval nhỏ Tròn, bìa nguyên, mô (không đỉnh), bề
mặt khô nhăn, màu trắng sữa 2,9 - -
D-CT2(4) Elip dài Tròn, bìa răng cưa, mô (có đỉnh), bề mặt
khô nhăn, màu trắng sữa 2,2 - -
Ghi chú: dấu “+” có khả năng phân giải, “ - ” không có khả năng phân giải. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình 3 lần lặp lại.
Các chủng nấm men phân lập không có khác biệt lớn về hình thái, kích thước khuẩn lạc: kích thước khuẩn lạc nhỏ (từ 1 đến 4 mm), đa số đều có bìa nguyên, trừ
chủng V-ST1(1), D-ST1(2), D-ST2(2), Đ-HG(1), Đ-HG(2), Đ-VL(2), Đ-VL(4), D- VL(3), V-CT2(1), D-CT2(1), D-CT2(4) bìa răng cưa; màu trắng sữa hoặc màu trắng đục; độ nổi mô chiếm đa số, chỉ một số chủng D-CT1(1), Đ-VL(3), Đ-HG(2) khuẩn lạc lài. Khi quan sát dưới kính hiển vi (ở vật kính E100), dựa vào đặc điểm hình dạng tế bào của 39 chủng nấm men đã phân lập có thể xếp thành 4 nhóm hình dạng đặc trưng.
Nhóm 1 - Tế bào nấm men hình oval nhỏ có 5 chủng: D-CT2(3), Đ-HG(2), Đ- ST1(1), V-CT2(2), V-VL(2).
Nhóm 2 - Tế bào nấm men hình oval lớn có 14 chủng: D-CT1(1), D-CT2(1), D- ST1(2), D-ST2(1), Đ-HG(1),Đ-ST1(2), Đ-ST2(1), Đ-VL(2), Đ-VL(4), V-CT1(2), V- HG(2), V-ST1(2), V-ST2(1), V-VL(1).
Nhóm 3 - Tế bào nấm men hình elip có 18 chủng: D-CT1(2), D-CT1(3), D- CT1(4), D-CT2(2), D-CT2(4), D-HG(1), D-ST1(1), D-ST2(2), D-VL(1), D-VL(3), Đ- HG(3), Đ-ST2(2), Đ-VL(1), Đ-VL(3), V-HG(1), V-CT2(1), V-ST1(1), V-ST2(2).
Nhóm 4 - Tế bào nấm men hình cầu có 2 chủng: D-VL(2), V-CT1(1).
Hình 9. Một số hình dạng đặc trưng của tế bào nấm men được phân lập
Ghi chú:(a): Nhóm 1- Nhóm tế bào hình oval nhỏ; (b): Nhóm 2- Nhóm tế bào hình oval lớn (c): Nhóm 3-Nhóm tế bào hình elip dài; d): Nhóm 4- Nhóm tế bào hình cầu
(a)
(d) (c)
Khả năng phân giải urea
Khả năng phân giải urea (hoạt tính urease) nhằm phát hiện ra nấm men có mang enzyme urease, đây là một trong những thí ngiệm được tiến hành để phân loại, định danh sơ bộ các chủng nấm men phân lập được.
Kết quả Bảng 3 cho thấy, trong tổng số 39 chủng nấm men khảo sát, chỉ có 1 chủng D-CT2(2) có khả năng phân giải urea (làm môi trường Christensen urea broth chuyển sang màu đỏ thẫm), chứng tỏ chủng nấm men này có mang enzyme urease.
Khả năng phân giải gelatine
Khả năng phân giải gelatine nhằm phát hiện ra nấm men có mang enzyme gelatinase, đây là một trong những thí ngiệm được tiến hành để phân loại, định danh