II. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.Chăm sóc cây trong v−ờn −ơm
3.1. Chăm sóc cây in vitro
Khi các cây nuôi cấy in vitro trong phòng đạt chiều cao xấp xỉ 3-4cm, mang 3-4 lá, dμi lá 4-5cm, số rễ 3-4 cái, thì có thể đ−a cây ra v−ờn −ơm. Lấy cây ra khỏi ống nghiệm vμ rửa sạch thạch, tránh lμm cây dập nát. Sau đó xử lý thuốc chống nấm vμ khuẩn trong 1-2 phút rồi trồng vμo giá thể xác định.
3.1.1. ảnh h−ởng của các loại giá thể
Các loại giá thể đ−ợc thử nghiệm: CT1: Rêu ngoại + Dớn (70:30) CT2: Rêu ngoại + Xơ dừa (70:30)
CT3: 40% than củi + 40% xơ dừa + 20% đá dăm đối với P. hangianum
CT3: Rêu ngoại + Đá bọt núi lửa (70:30) đối với P. gratrixianum
Hỡnh 18: Cỏc loại giỏ thể trồng Lan
Rờu ngoại Dớn
Rờu Sa Pa Xơ dừa
Mỗi công thức đặt 10-20 chậu, theo dõi trong 4 tháng. Tiến hμnh theo dõi các chỉ tiêu sinh tr−ởng: tỷ lệ sống, số lá, dμi lá, rộng lá sau các tháng thí nghiệm.
3.1.2. ảnh h−ởng của chế độ bón phân
Các cây con khi mới đ−a ra v−ờn −ơm đ−ợc t−ới phun s−ơng, sau 4 tuần mới tiến hμnh thí nghiệm phân bón. Phân bón đ−ợc dùng lμ phân bón của Mỹ “Grow more” tỷ lệ N:P:K: 30:10:10 với nồng độ 0,5g/l. Thử nghiệm số lần bón phân lμ 1 lần/tuần vμ 2 lần/tuần. Mỗi công thức đặt 10-20 chậu, theo dõi trong 4 tháng. Tiến hμnh theo dõi các chỉ tiêu sinh tr−ởng: số lá, dμi lá, rộng lá sau các tháng thí nghiệm.
3.2. Chăm sóc cây in vivo
3.2.1. Chăm sóc cây tách mầm
3.2.1.1. ảnh h−ởng của giá thể:
Các loại giá thể thí nghiệm lμ: CT1: Rêu ngoại + Dớn (70:30) CT2: Rêu ngoại + Xơ dừa (70:30)
CT3: Rêu ngoại + Đá bọt núi lửa (70:30) CT4: Rêu nội (rêu Sa Pa) + Dớn (70:30)
Mỗi công thức đặt 10-20 chậu, theo dõi trong 4 tháng. Tiến hμnh theo dõi các chỉ tiêu sinh tr−ởng: số lá, dμi lá, rộng lá sau các tháng thí nghiệm.
Phân bón đ−ợc dùng lμ phân bón của Mỹ “Grow more” tỷ lệ N:P:K: 30:10:10 với nồng độ 0,5g/l. Thử nghiệm số lần bón phân lμ 1 lần/tuần vμ 2 lần/tuần. Mỗi công thức đặt 10-20 chậu, theo dõi trong 4 tháng. Tiến hμnh theo dõi các chỉ tiêu sinh tr−ởng: số lá, dμi lá, rộng lá sau các tháng thí nghiệm.
4. Theo dõi nhiệt độ vμ ánh sáng trong v−ờn −ơm:
- Điều chỉnh ánh sáng trong v−ờn −ơm bằng hệ thống l−ới theo mùa - Theo dõi nhiệt độ trung bình các mùa trong v−ờn −ơm.
5. Theo dõi sâu bệnh vμ cách phòng chống
III. Điều tra hiện trạng hai loμi Lan Hμi đ−ợc nghiên cứu
Tiến hμnh đi thực địa ở nơi sinh sống của P. hangianum vμ P. gratrixianum, điều tra theo dõi trên thị tr−ờng buôn bán lan rừng vμ tham khảo tμi liệu.
Phần c - Kết quả vμ thảo luận
I.Nhân giống bằng ph−ơng pháp gieo hạt in vitro
1. Tạo nguyên liệu ban đầu
Hạt đ−ợc lấy từ quả thu hái từ thực địa hoặc quả đ−ợc thụ phấn từ cây trong v−ờn −ơm của Trung tâm Sinh học thực nghiệm.
Chọn các bông hoa vừa nở 3-4 ngμy trên cây Lan Hμi khoẻ mạnh để thụ phấn lμ tốt nhất. Bỏ cánh môi trên cây mẹ, rồi lấy hai khối phấn từ cây bố đặt vμo khoang noãn của cây mẹ. Tránh t−ới n−ớc vμo cây hoa mới đ−ợc thụ phấn. Sau vμi ngμy khoang noãn phình to, cánh hoa héo dần vμ quả bắt đầu hình thμnh. Khi quả đạt độ tuổi xác định, thu hái để tiến hμnh gieo hạt.
Hỡnh 20: Cõy P. hangianum mang quả trong vườn ươm
Hỡnh 21: Quả P. hangianum (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thí nghiệm đã d−ợc tiến hμnh để xác định môi tr−ờng khoáng, tuổi quả thích hợp để gieo hạt P. hangianum vμ P. gratrixianum. Đồng thời cũng tiến hμnh nghiên cứu các chất bổ sung thích hợp cho sự nảy mầm của P. gratrixianum
1.1. ảnh h−ởng của môi tr−ờng khoáng đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt P.
hangianum vμ P. gratrixianum
Các thử nghiệm về ảnh h−ởng của các môi tr−ờng khoáng khác nhau đối với sự nẩy mầm của hạt Lan Hμi đã đ−ợc thực hiện nhằm tìm ra môi tr−ờng gieo hạt thích hợp cho hai loμi Lan Hμi đ−ợc nghiên cứu. Các môi tr−ờng nμy đ−ợc lựa chọn từ các môi tr−ờng th−ờng đ−ợc sử dụng nuôi cấy in vitro các loμi Lan.
Kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nẩy mầm của hạt hai loμi Lan Hμi P. hangianum vμ P. gratrixianum đ−ợc thử nghiệm gieo trên các môi tr−ờng khoáng khác nhau đ−ợc trình bμy trên bảng 1 vμ biểu đồ 1.
Bảng 1: Tỉ lệ nẩy mầm của hạt Lan Hài trờn cỏc mụi trường khoỏng khỏc nhau
Tỷ lệ nẩy mầm (%) Loμi Thời gian (ngμy) MS 1/2 MS HY VW RE 60 6 7 5 8 9 P.hangianum 90 38 45 25 47 67 60 1 5 4 8 12 P.gratrixianum 90 15 25 10 30 50
0 20 40 60 80 MS 1/2 MS HY VW RE Môi tr−ờng khoáng Tỷ lệ nảy mầ m ( % ) P. hangianum P. gratrixianum
Biểu đồ 1: Tỉ lệ nảy mầm của P. hangianum và P. gratrixianum trờn cỏc mụi trường khỏc nhau
Kết quả từ bảng 1, biểu đồ 1 cho thấy sau 90 ngμy gieo hạt, P. hangianum
đạt tỷ lệ nẩy mầm cao nhất trên môi tr−ờng RE (67%), P. gratrixianum cũng đạt tỷ lệ nẩy mầm cao nhất trên môi tr−ờng RE (50%). Môi tr−ờng VW vμ 1/2 MS cũng cho tỷ lệ nảy mầm khá.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy hạt Lan Hμi nói chung nẩy mầm khó vμ chậm hơn so với Lan Hồ Điệp cũng nh− một số loμi Lan khác. Tuy vậy, đối với Lan Hμi đ−ợc cho lμ loμi Lan khó nẩy mầm thì tỷ lệ nẩy mầm trên đây lμ khá tốt.
Nh− vậy, đối với P. hangianum vμ P. gratrixianum việc sử dụng môi tr−ờng khoáng RE để gieo hạt cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất.
1.2. ảnh h−ởng của tuổi quả đến sự nẩy mầm hạt P. hangianum vμ P.
gratrixianum
Kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nẩy mầm của hạt Lan Hμi ở các độ tuổi khác nhau đ−ợc trình bμy trên bảng 2, biểu đồ 2.
Hỡnh 23: Nảy mầm của hạt P. hangianum trờn mụi trường RE
Hỡnh 24: Nảy mầm của hạt P. gratrixianum trờn mụi trường RE
Kết quả từ bảng 2 vμ biểu đồ 2 cho thấy: Sau 1 tháng theo dõi, hạt của cả hai loμi Lan Hμi với độ tuổi 6 vμ 8 tháng đều ch−a có dấu hiệu nảy mầm, trong khi đó hạt 10 tháng tuổi của P. hangianum đạt 7% vμ P. gratrixianum đạt 12% nảy mầm sau 1 tháng. Kết quả nghiên cứu cho thấy: cả hai loμi Lan Hμi P. hangianum vμ P. gratrixianum đều đạt tỷ lệ nẩy mầm cao nhất với hạt có 10 tháng tuổi. ở tuổi nμy sau 3 tháng gieo hạt, tỷ lệ nẩy mầm của P. hangianum lμ 68% vμ của P. gratrixianum lμ 75%.
Bảng 2: Sự nảy mầm của hạt Lan Hài ởđộ tuổi khỏc nhau
Tỷ lệ nẩy mầm (%) Loμi Tuổi quả
(tháng) Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng
6 0 0 2 8 0 9 18 P. hangianum 10 7 38 68 6 0 1 3 8 0 5 25 P.gratrixianum 10 12 48 75 0 10 20 30 40 50 60 70 80 6 8 10 Tuổi quả (thỏng) T ỉ l ệ n ả y m ầ m ( % ) P. hangianum P.gratrixianum Biểu đồ 2: Tỉ lệ nẩy mầm của hạt sau 3 thỏng gieo
Theo nhiều nhμ nghiên cứu, nói chung hạt các loμi lan có thể nẩy mầm ở giai đoạn ch−a chín (5-6 tháng tuổi). Ví dụ: Lan Hồ Điệp có thể nẩy mầm tốt ở độ tuổi khoảng 4-6 tháng, Lan Cypripedium: 3,5 tháng. Một số loμi Lan khác nảy mầm ở giai đoạn tuổi lớn hơn: Miltonia: 9 tháng, Dendrobium: 12 tháng,
Cymbidium: 10 tháng.
Các kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác về tỷ lệ nảy mầm của hạt Lan Hμi ở các độ tuổi khác nhau cho thấy: Tùy theo từng loμi, hạt Lan Hμi có thể nảy mầm tốt trong khoảng từ 4 đến 10 tháng tuổi. Theo Lý Niên vμ Lý Dũng Nghị, tuổi quả thích hợp để nảy mầm P. delenatii (Hμi Hồng) lμ 5 tháng, P.
philippinense: 4 tháng. Theo Saitho N. vμ Misawa M (2002): tuổi quả thích hợp để gieo hạt P. armeniacum vμ P. micranthum lμ 6-8 tháng.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ nẩy mầm của hai loμi Lan Hμi Hằng vμ Hμi Tam Đảo đạt cao nhất ở hạt có tuổi quả lμ 10 tháng tuổi. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nhận xét của Luke (1971) cho rằng dù hạt lan có thể nảy mầm khi mới đạt đ−ợc 1/2 giai đoạn chín nh−ng gieo hạt từ quả đã đạt 2/3 giai đoạn chín vẫn cho kết quả tốt hơn.
1.3. ảnh h−ởng của các chất bổ sung đến sự nảy mầm của hạt P.
gratrixianum (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do thiếu nguồn giống Lan P. hangianum nên những thí nghiệm về ảnh h−ởng của các chất bổ sung chỉ đ−ợc thực hiện với P. gratrixianum.
1.3.1. ảnh h−ởng của hμm l−ợng đ−ờng.
Đ−ờng có vai trò quan trọng trong nhân giống in vitro nói chung vμ cây Lan nói riêng. Đ−ờng đặc biệt quan trọng đối với những cây nảy mầm trong bóng tối nh− Lan Hμi vì lúc nμy chúng sinh tr−ởng hòan tòan dị d−ỡng. Nói chung hμm l−ợng đ−ờng th−ờng đ−ợc bổ sung để nuôi cấy Lan lμ khoảng 20g/l. Đối với loμi Lan Hμi mới đ−ợc nghiên cứu nμy, chúng tôi đã tiến hμnh thử nghiệm để xác định hμm l−ợng đ−ờng thích hợp nhất cho môi tr−ờng gieo hạt.
Các kết quả nghiên cứu đ−ợc trình bμy trên bảng 3 vμ biểu đồ 3.
Từ các kết quả trên bảng 3 nhận thấy việc bổ sung đ−ờng có tác dụng tốt đối với sự nẩy mầm của hạt Lan P. gratrixianum, tỷ lệ nẩy mầm tăng dần khi tăng nồng độ đ−ờng từ 10g/l lđến 25g/l. ở nồng độ đ−ờng 20g/l cho tỷ lệ nẩy mầm khá tốt: đạt tỷ lệ 50% sau 3 tháng. Tuy vậy nồng độ đ−ờng 25g/l môi tr−ờng đã cho kết quả nẩy mầm cao nhất: tỷ lệ nẩy mầm đạt 65% sau 3 tháng.
Bảng 3: Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến tỉ lệ nảy mầm của P. gratrixianum
Tỷ lệ nẩy mầm (%) Hμm l−ợng
đ−ờng (g/l) Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng
10 8 2 3 15 1 3 28 20 3 17 50 25 5 25 65 30 4 12 37 35 2 5 17
Biểu đồ 3: Tỉ lệ nẩy mầm của P. gratrixianum sau 3 thỏng gieo cấy
1.3.2. ảnh h−ởng của việc bổ sung dịch chuối
Chúng tôi đã tiến hμnh thử nghiệm tác dụng của dịch chuối ở các nồng độ khác nhau đ−ợc bổ sung vμo môi tr−ờng gieo hạt P. gratrixianum.
Các kết quả đ−ợc trình bμy trên bảng 4.
Kết quả nghiên cứu trên bảng 4 cho thấy việc bổ sung dịch chuối vμo môi tr−ờng gieo hạt P. gratrixianum không cho kết quả tích cực. ở các nồng độ chuối khác nhau đều nhận thấy tỷ lệ nảy mầm thấp hơn so với đối chứng.
0 10 20 30 40 50 60 70 10 15 20 25 30 35 Hàm lượng đường (g/L) T ỉ l ệ n ẩ y m ầ m ( % )
Bảng 4: Ảnh hưởng của dịch chuối đến nảy mầm của P. gratrixianum
Tỷ lệ nẩy mầm (%) Hμm l−ợng dịch
chuối (g/l) Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng
0 0 1 52
50 0 1 13
100 1 3 10
150 0 0 0
250 0 0 0
1.3.3. ảnh h−ởng của bổ sung than hoạt tính.
Các nghiên cứu đã đ−ợc tiến hμnh để thử nghiệm khả năng nẩy mầm của
P.gratrixianum trong điều kiện môi tr−ờng có vμ không có than hoạt tính.
Kết quả đ−ợc trình bμy trên bảng 5.
Bảng 5: Ảnh hưởng của than hoạt tớnh đến nẩy mầm của hạt P. gratrixianum
Tỷ lệ nẩy mầm (%) Hμm l−ợng than
hoạt tính (g/l) Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0 0 7 25
2 5 20 75
Kết quả thử nghiệm cho thấy việc bổ sung than hoạt tính có tác dụng tốt hơn hẳn đối với sự nẩy mầm của P. gratrixianum so với điều kiện không có than hoạt tính. Khi bổ sung than hoạt tính với nồng độ 2g/l, tỷ lệ nẩy mầm lμ 75% sau 3 tháng. Trong khi đó ở môi tr−ờng không có than hoạt tính, tỷ lệ nẩy mầm chỉ đạt 25% sau 3 tháng.
Có ý kiến cho rằng trong giai đoạn nẩy mầm của hạt Lan không nên sử dụng than hoạt tính để bổ sung vμo môi tr−ờng gieo hạt (Ernst, 1975). Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi cho rằng có lẽ điều nμy có thể thay đổi tuỳ theo loμi, đối với một số loμi Lan Hμi, việc bổ sung than hoạt tính không có tác dụng tích cực
đối với sự nảy mầm, trong khi đó đối với một số loμi nh− P. gratrixianum thì lại nhận thấy tác dụng tích cực.
2. Giai đoạn nhân nhanh
Những thông báo về nghiên cứu nhân nhanh Lan Hμi hiện nay ch−a có nhiều vμ th−ờng tập trung vμo các loμi Lan Hμi lai, có lẽ đó lμ vì việc nhân nhanh các loμi bản địa thuần chủng th−ờng gặp nhiều khó khăn hơn.
Những nghiên cứu b−ớc đầu đã đ−ợc thực hiện nhằm tìm hiểu những điều kiện ảnh h−ởng đến việc nhân nhanh hai loμi Lan Hμi P. hangianum vμ P. gratrixianum.
Hỡnh 25: Lan Hài giai đoạn nhõn nhanh
2.1. ảnh h−ởng của môi tr−ờng khoáng đến việc nhân nhanh P. hangianum
vμ P. gratrixianum
Việc tìm một môi tr−ờng khoáng thích hợp để gia tăng số l−ợng chồi Lan Hμi có chất l−ợng tốt với hệ số nhân mong muốn lμ rất cần thiết. Chúng tôi đã thử nghiệm nhân nhanh trên 6 môi tr−ờng khoáng vμ kết quả sau 12 tuần nuôi cấy đ−ợc trình bμy trên bảng 6 vμ biểu đồ 4.
Kết quả trên bảng 6 cho thấy sau 12 tuần nuôi cấy, hệ số nhân của cả hai loμi Lan Hμi đều đạt cao nhất ở môi tr−ờng RE, tại đó hệ số nhân của P.
hangianum lμ 4,8 vμ của P. gratrixianum lμ 4,3. Hệ số nhân đạt khá ở môi tr−ờng 1/2 MS vμ sau đó giảm dần ở HY vμ MS. Hệ số nhân thấp nhất lμ ở môi tr−ờng VW vμ BN.
Bảng 6: Ảnh hưởng của mụi trường khoỏng khỏc nhau đến nhõn nhanh (lần)
Môi tr−ờng khoáng Loμi
MS 1/2 MS VW BN RE HY
P.hangianum 1,8 3,2 1,7 1,2 4,8 2,5
P.gratrixianum 2,0 3,2 1,3 1,4 4,3 2,1
Biểu đồ 4: Hệ số nhõn ở cỏc mụi trường khoỏng khỏc nhau
2.2. ảnh h−ởng của pH
Chỉ số pH môi tr−ờng lμ một yếu tố rất quan trọng trong nuôi cấy Lan cũng nh− nhiều cây khác. Kết quả nghiên cứu ảnh h−ởng của độ pH khác nhau đối với việc nhân nhanh hai loμi P. hangianum vμ P. gratrixianum đ−ợc trình bμy trên bảng 7 vμ biểu đồ 5. 0 1 2 3 4 5 6 MS 1/2 MS VW BN RE HY Mụi trường khoỏng
H ệ s ố nhõn ( l ầ n) P.hangianum P.gratrixianum
Kết quả từ bảng 7 cho thấy P. hangianum vμ P. gratrixianum đều có hệ số nhân chồi cao nhất ở pH = 6,0. ở pH = 5,5; pH= 6,5 vμ 7,0 hệ số nhân của P.
hangianum t−ơng đối khá. Trong thí nghiệm của chúng tôi nói chung hệ số nhân của P. gratrixianum kém hệ số nhân của P. hangianum ở tất cả các pH đ−ợc thử nghiệm.
Bảng 7: Ảnh hưởng của pH đối với nhõn nhanh P. hangianum và P. gratrixianum Hệ số nhân chồi (lần) Loμi pH 4.5 PH 5.0 pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH 7.0 P.hangianum 1,5 2,2 3,5 5,0 4,7 3,8 P.gratrixianum 0,8 1,3 2,5 3,3 2,8 2,5 Biểu đồ 5: Ảnh hưởng của pH tới hệ số nhõn
2.3. ảnh h−ởng của kinetin vμ các chất bổ sung tới nhân nhanh P.
hangianum vμ P. gratrixianum
Các thí nghiệm ảnh h−ởng của việc bổ sung kinetin, pepton, dịch chuối, dịch cμ rốt đối với quá trình nhân nhanh đ−ợc thực hiện đối với cả hai loμi P.
hangianum vμ P. gratrixianum. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do thiếu nguồn giống P. hangianum nên các thí nghiệm về ảnh h−ởng của BAP, tổ hợp BAP + NAA vμ dịch táo chỉ đ−ợc thực hiện với P. gratrixianum.
0 1 2 3 4 5 6 4.5 5 5.5 6 6.5 7 pH H ệ s ố nhõn ( l ầ n) P.hangianum P.gratrixianum
2.3.1. ảnh h−ởng của kinetin
Việc nghiên cứu ảnh h−ởng của các chất điều hòa sinh tr−ởng trong nhân nhanh Lan Hμi hầu nh− còn đ−ợc đề cập rất ít. Chúng tôi đã tiến hμnh nghiên cứu ảnh h−ởng của Kinetin đối với quá trình nhân nhanh P. hangianum vμ P. gratrixianum. Kết quả nghiên cứu đ−ợc trình bμy trên bảng 8 vμ biểu đồ 6.
Bảng 8: Ảnh hưởng của kinetin đến quỏ trỡnh nhõn nhanh P. hangianum và P. gratrixianum Hệ số nhân (lần) Loμi 0ppm 0,2ppm 0,4ppm 0,6ppm 0,8ppm 1,0ppm P.hangianum 5,4 5,9 7,0 5,6 4,5 4,2 P.gratrixianum 3,8 4,5 6,7 6,0 4,9 3,5
Kết quả từ bảng 8 vμ biểu đồ 6 cho thấy cả hai loμi P. hangianum vμ P. gratrixianum đều có hệ số nhân cao nhất ở nồng độ Kinetin 0,4mg/l, tại đó hệ số nhân của P. hangianum lμ 7,0 vμ của P. gratrixianum lμ 6,7. Nh− vậy, việc bổ sung Kinetin đã có tác dụng kích thích đối với sự gia tăng chồi P. hangianum vμ