II. Ph−ơng pháp nghiên cứu
1. Ph−ơng pháp gieo hạt in vitro
1.2 Giai đoạn nhân nhanh
Khi các mầm hạt lan chuyển sang mầu xanh, chúng đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng nhân nhanh để gia tăng số l−ợng chồi lan hμi. Chúng tôi đã tiến hμnh nghiên cứu ảnh h−ởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh.
Bố trí thí nghiệm: Số mẫu cấy trong mỗi bình tam giác lμ 5 chồi. Mỗi công thức thí nghiệm đ−ợc bố trí 5 lần nhắc lại. Các bình thí nghiệm đ−ợc đặt trong phòng nuôi cây có c−ờng độ chiếu sáng 2500Lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngμy, nhiệt độ phòng 25±2oC. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống, khả năng sinh tr−ởng vμ phát triển của chồi, hệ số nhân chồi (lần) sau 12 tuần thí nghiệm.
Cách tính hệ số nhân (lần):
Tổng số chồi ban đầu + Tổng số chồi mới Hệ số nhân (lần) = --- Tổng số chồi ban đầu
1.2.1. ảnh h−ởng của các môi tr−ờng khoáng khác nhau đến hệ số nhân
Các thử nghiệm trong phần nhân nhanh hai loμi Lan Hμi P. hangianum vμ
P. gratrixianum đ−ợc thực hiện trên nền các môi tr−ờng khoáng khác nhau với các chất bổ sung nh− sau:
Công
thức Môi tr−ờng cơ bản Các chất bổ sung
1 Murashige & Skoog (MS)
2 1/2 MS
3 Vacin Went (VW)
4 Burgeff N3f
5 Robert Ernst (RE)
6 Hyponex (3g/l) 20g đ−ờng + 150ml n−ớc dừa + 7g thạch + 2g than hoạt tính trong 1 lít môi tr−ờng pH: 5,5-6 1.2.2. ảnh h−ởng của pH môi tr−ờng
Cấy khoảng 5 chồi vμo bình tam giác 250ml đã đ−ợc đổ sẵn môi tr−ờng khoáng thích hợp (từ kết quả thí nghiệm 2.1) có bổ sung: 150ml n−ớc dừa + 20g đ−ờng + 7g thạch + 2g than hoạt tính / 1 lít môi tr−ờng với các pH thử nghiệm khác nhau: 4; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0.
1.2.3 ảnh h−ởng của kinetin
Đặt thí nghiệm t−ơng tự nh− thí nghiệm (2.2) với các nồng độ Kinetin đ−ợc thử nghiệm lμ: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0ppm.
1.2.4 ảnh h−ởng của pepton
Đặt thí nghiệm t−ơng tự nh− thí nghiệm (2.2) với các hμm l−ợng pepton đ−ợc thử nghiệm lμ: 0; 1; 2; 3; 4g/l.
1.2.5. ảnh h−ởng của dịch chuối
Đặt thí nghiệm t−ơng tự thí nghiệm (2.2) pH 5,5-6,0 với các hμm l−ợng dịch chuối đ−ợc thử nghiệm lμ: 0; 30; 60; 90; 120; 150g/l.
1.2.6. ảnh h−ởng của dịch cμ rốt
Đặt thí nghiệm t−ơng tự nh− thí nghiệm (2.2) với các hμm l−ợng cμ rốt đ−ợc thử nghiệm lμ: 0; 10; 20; 30; 40; 50g/l
1.2.7. ảnh h−ởng của BAP
Đặt thí nghiệm t−ơng tự nh− thí nghiệm (2.2) với các nồng độ BAP thử nghiệm lμ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0ppm.
1.2.8. ảnh h−ởng của tổ hợp BAP+NAA
Đặt thí nghiệm t−ơng tự nh− thí nghiệm (2.2) có bổ sung 0,5ppm BAP với các nồng độ NAA lần l−ợt lμ 0,8; 1,0; 1,2ppm.
0,5ppm BAP + 0,8ppm NAA 0,5ppm BAP + 1,0ppm NAA 0,5ppm BAP + 1,2ppm NAA
1.2.9. ảnh h−ởng của dịch táo
Đặt thí nghiệm t−ơng tự nh− thí nghiệm (2.2) với các hμm l−ợng táo đ−ợc thử nghiệm lμ 0; 10; 20; 30; 40; 50g/l.