- Làm trịn kết quả tính được và biểu thị kết quả theo biểu thức: nx10 x CFU/g hoặc ml thực phẩm.
PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
3.3.3. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Áp dụng theo AOAC 2007 (975.55)
Áp dụng theo AOAC 2007 (975.55)
Nguyên tắc:
+ Hình thái khuẩn lạc điển hình trên mơi trường Baird-Parker sau khi ủ 35oC/48h.
+ Thử nghiệm Coagulase: dương tính
Chuẩn bị mẫu
-Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vơ trùng cho tới khi được thể đồng .
-Nếu mẫu thử đơng phải làm tan băng trước khi làm xét nghiệm.
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1
Cân chính xác 10g mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị cho vào túi nilon vơ trùng Thêm 90ml nước đệm phosphate và đồng nhất mẫu trong vịng 2 phút,thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2 , 10-3
-Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước đệm phosphate, lắc đều,thu được dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử 10-3
Bước 1: cấy mẫu
- Từ nồng độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3, lấy 1ml dung dịch mẫu thử cho sang 3 đĩa thạch Baird-Parker (thể tích mẫu thử cho vào 3 đĩal lần lượt là: 0,4, 0,3, 0,3 ml)
- Dùng que trang vơ trùng, dàn mẫu thử cẩn thận lên mặt đĩa thạch, cố gắng khơng chạm vào mép đĩa. Để các đĩa cĩ nắp đậy cho đến khơ trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phịng. Nếu các đĩa này chưa khơ thì cĩ thể đặt các đĩa (khơng lật ngược đĩa) vào tủ ủ 1h.
- Lật ngược các đĩa, ủ trong tủ ấm ở 35 0C trong 24-48 h.
Bước 2: Đọc kết quả
Sau 24 giờ trên mơi trường Baird Paker agar, khuẩn lạc S. aureus cĩ đường kính 0,5 – 1 mm, lồi, đen bĩng cĩ vịng sáng rộng khỏang 1 – 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc cĩ đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus cĩ đường kính khoảng 1 – 1,5 mm, màu đen bĩng, lồi, cĩ vịng trắng đục hẹp và cĩ vịng sáng rộng khoảng 2 ‒ 4 mm bao quanh. Cĩ một số dịng S. aureus cho khuẩn lạc khơng đặc trưng. Cần đếm và đánh dấu hai dạng khuẩn lạc.
Hình 3.1. Khuẩn lạc S. aureus trên mơi trƣờng Baird Paker Bước 3:
Khẳng định
- Chọn 5 khuẩn lạc của mỗi dạng khuẩn lạc đã chọn đếm ở bước 2 và tiến hành thử nghiệm coagulase như sau:
- Dùng đầu que cấy thẳng vơ trùng, cấy chuyển mỗi khuẩn lạc nghi ngờ đã chọn vào mỗi ống nghiệm cĩ chứa sẵn 0,2 ml mơi trường canh thang BHI và đồng thời cấy ria lên mỗi ống thạch nghiêng của mơi trường bảo quản chủng như TSA. Ử ấm ở 35oC/ 18-24h.
+ Thêm 0,3 ml huyết tương thỏ đã hồn nguyên vào mỗi ống dịch nuơi cấy BHI, lắc đều. Ử ấm 35o và kiểm tra sự đơng tụ của huyết tương sau , 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Sự đơng tụ huyết tương ở bất cứ mức độ nào cũng được xem là phản ứng dương tính. Những cục đơng tụ huyết tương nhỏ hoặc yếu cĩ thể quan sát bằng cách nghiêng nhẹ ống nghiệm để cho phần dung dịch của hỗn hợp phản ứng đến gần phía miệng ống nghiệm, cịnnhững cục đơng tụ huyết tương sẽ nhơ ra ở trên bề mặt dung dịch.
+ Các ống nuơi cấy trên thạch nghiêng được giữ lại ở nhiệt độ phịng để sử dụng trong trường hợp thử nghiệm coagulase cĩ vấn đề nghi ngờ cần thử nghiệm lại.
- Những ống dịch nuơi cấy BHI cĩ thử nghiệm coagulase dương tính được coi là S.aureus.
ình 3.2. Kết quả phản ứng coagulase Bước 4: Tính tốn và báo cáo kết quả
+ Tính tốn số khuẩn lạc A trên mỗi đĩa thạch Baird-Parker cho kết quả thử nghiệm coagulase dương tính theo cơng thức sau:
A= BCCC / Ac +BncCnc /Anc Trong đĩ:
Ac là số khuẩn lạc điển hình đem thử phản ứng coagulase.
BC là số khuẩn lạc điển hình đem thử phản ứng coagulase dương tính CC là tổng số khuẩn lạc điển hình thấy trên đĩa
Anc số khuẩn lạc khơng điển hình đem thử phản ứng coagulase.
Bnc số khuẩn lạc khơng điển hình đem thử phản ứng coagulase dương tính Cnc là tổng số khuẩn lạc khơng điển hình thấy trên đĩa
Lấy kết quả trịn số
+ Tính số lượng vi khuẩn S.aureus (N) cĩ mặt trong 1g mẫu thử theo cơng thức N =
Trong đĩ: là tổng số khuẩn lạc cho kết quả thử nghiệm coagulase dương tính trên 3 đĩa đã chọn.
d: độ pha lỗng của 3 đĩa đã chọn
- Làm trịn kết quả tính được và biểu thị kết quả theo biểu thức: nx10x CFU/ghoặc ml thực phẩm. hoặc ml thực phẩm.
Trong đĩ: n số thập phân tương ứng từ 1,0 đến 9,9. x: số mũ phù hợp của 10.
+ Nếu cả 3 đĩa thạch của nồng độ pha lỗng đầu tiên khơng chứa bất kỳ khuẩn lạc nào cho kết quả thử nghiệm coagulase dương tính thì báo cáo kết quả như sau:
Quy trình định lựợng S. aureus