- Làm trịn kết quả tính được và biểu thị kết quả theo biểu thức: nx10 x CFU/g hoặc ml thực phẩm.
3.1.2. 2 Kỹ thuật MPN
Áp dụng theo AOAC 2007 (987.09) Nguyên tắc :
- Tiêu chuẩn để xác định Staphylococcus aureus lá dựa vào các đặc điểm sau: + S.aureus mọc được trên mơi trường canh thang TSB cĩ bổ sung thêm 10% NaCl và 1% sodium pyruvate.
+ Hình thái khuẩn lạc điển hình trên mơi trường thạch Baird-Parker sau khi ủ 350C/48h
+ Thử nghiệm Coagulase: dương tính
Chuẩn bị mẫu
- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn băng máy trong điều kiện vơ trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
- Nếu mẫu thử đơng phải làm tan băng trước khi làm xét nghiệm.
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1
Cân chính xác 45g mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị hoặc hút chính xác 45 ml mẫu thực phẩm lỏng cho vào túi nilon vơ trùng (hay cân 10g mẫu thực phẩm/10ml thực phẩm lỏng).Thêm 450 ml nước đệm phosphate (hay 90ml nước đệm phosphate) và đồng nhất mẫu trong vịng 2 phút,thu được dung dịch mẫu thử 10-1
Hút chính xác 10 ml (hoặc 1ml)dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang chai dural chứa sẵn 90 ml nước đệm phosphate (hoặc ống nghiệm cĩ chhứa sẵn 9 ml nước đệm phosphate), lắc đều,thu được dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử 10-2, 10-3…
Thực hiện:
Bước 1: Cấy mẫu
- Lấy 1ml dung dịch mẫu thử 10-1, 10-2, 10-3……cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10ml canh thang TSB cĩ 10% NaCl và 1% Sodium pyruvate. Mỗi đậm độ cấy 3 ống.
+ Riêng với mẫu thực phẩm lỏng cĩ thể thực hiện xét nghiệm như sau: hút trực tiếp 1ml dung dịch mẫu thử nguyên thuỷ (100) và nồng độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10- 3…… cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10ml canh thang TSB cĩ 10% NaCl và 1% Sodium pyruvate. Mỗi đậm độ cấy 3 ống.
- Ủ ấm 350C/48h.
Bước 2: Cấy chuyển
- Staphylococus aureus phát triển trong mơi trường canh thang TSB với 10% NaCl và 1% Sodium pyruvate làm đục mơi trường.
- Dùng que cấy vịng cấy ria một vịng dịch nuơi cấy lên bề mặt đĩa thạch Baird- Parker để sao cho thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ ràng, mỗi ống dịch nuơi cấy cấy ria lên một đĩa thạch. Ủ các đĩa thạch này ở 350C/48h
Bước 3: Quan sát và nhận định khuẩn lạc điển hình của Staphylococus aureus trên mơi trường thạch Baird-Parker
- Trên mơi trường thạch Baird-Parker: Khuẩn lạc trịn, nhẵn, lồi, ướt, đường kính 2-3mm màu xám đến đen nhánh; và thường được bao quanh bởi một vịng sang hoặc vịng trắng đục.
- Thỉnh thoảng các chủng khơng phân giải lipit cĩ thể cĩ hình dạng khuẩn lạc tương tự nhưng chúng cĩ vịng trắng đục và vịng sáng xung quanh khuẩn lạc.
- Những khuẩn lạc được phân lập từ mẫ đơng hoặc sấy khơ mà được bảo quản trong thời gian dài thì khuẩn lạc thường ít đen hơn và khuẩn lạc cĩ thể cĩ dạng nhám và khơ.
Bước 4: thử nghiệm khẳng định
- Từ mỗi đĩa thạc Baird-Parker, chọn lấy ≥ 1 khuẩn lạc nghi ngờ là S.aureus để thực hiện thử nghiệm Coaglulase.
- Dùng đầu que cấy thẳng vơ trùng, cấy chuyển mỗi khuẩn lạc nghi ngờ đã chọn vào mỗi ống nghiệm cĩ chứa sẵn 0,2 ml mơi trường canh thang BHI và đồng thời cấy ria lên mỗi ống thạch nghiêng của mơi trường bảo quản chủng như TSA hoặc Nutrient agar …Ử ấm ở 35oC/ 18-24h.
+ Thêm 0,5 ml huyết tương thỏ đã hồn nguyên vào mỗi ống dịch nuơi cấy BHI, lắc đều. Ử ấm 35o và kiểm tra sự đơng tụ của huyết tương sau mỗi giờ, 6 giờ. Sự đơng tụ huyết tương ở bất cứ mức độ nào cũng được xem là phản ứng dương tính. Những cục đơng tụ huyết tương nhỏ hoặc yếu cĩ thể quan sát bằng cách nghiêng nhẹ ống nghiệm để cho phần dung dịch của hỗn hợp phản ứng đến gần phía miệng ống nghiệm, cịnnhững cục đơng tụ huyết tương sẽ nhơ ra ở trên bề mặt dung dịch.
+ Kiểm tra lại các kết quả thử nghiệm coagulase của dịch nuơi cấy BHI trong khoảng thời gian > 18h nhưng < 48h ở 350C.
+ Cần thực hiện đồng tời các thử nghiệm chứng âm và chứng dương cho thử nghiệm coagulase.
+ Các ống nuơi cấy trên thạch nghiêng được giữ lại ở nhiệt độ phịng để sử dụng trong trường hợp thử nghiệm coagulase cĩ vấn đề nghi ngờ cần thử nghiệm lại.
- Những ống dịch nuơi cấy BHI cĩ thử nghiệm coagulase dương tính được coi là S.aureus.
-Đối với mỗi nồng độ pha lỗng, ghi lại số ống dương tính (+) dựa vào kết quả thử nghiệm coagulase.
- Tra bảng MPN ở nồng độ tương ứng, tính số MPN của S.aureus trong 1 g thực phẩm hoặc 1 ml thực phẩm.
Ví dụ Nồng độ 10-1: cĩ 3 ống (+): 3 ống cho thử nghiệm coagulase dương tính Nồng độ 10-2: cĩ 1 ống (+): 1 ống cho thử nghiệm coagulase dương tính Nồng độ 10-3: cĩ 0 ống (+)
Tra bảng MPN, xác định trong 1 g mẫu thử cĩ 43 MPN.