3.1. Phương pháp truyền thống
Cho dung dịch mẫu vào mơi trường TSB, ủ 37 oC trong 24 giờ, sau đĩ cấy ria lên mơi trường thạch BP (Baird Paker), ủ 37 OC trong 48 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên mơi trường BP cĩ màu đen nhánh, sáng, trịn, lồi, đường kính 1-1,5 mm, cĩ vịng sáng chung quanh khuẩn lạc để cấy sang mơi trường BHI (Brain Heart Infusion), ủ 37 OC trong 24 giờ. Sau đĩ cấy sang ống nghiệm nhỏ cĩ chứa 0,3 ml huyết tương để thử phản ứng đơng kết (phản ứng coagulase), thực hiện song song một ống đối chưng khơng được cấy dịch vi sinh vật, theo dõi kết quả đơng huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Mẫu được kết luận là cĩ S. aureus khi thử nghiệm coagulase dương tính.
3.1.2. Phương pháp định lượng
3.1.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (phương pháp hộp trãi)Áp dụng theo AOAC 2007 (975.55) Áp dụng theo AOAC 2007 (975.55)
Nguyên tắc:
+ Hình thái khuẩn lạc điển hình trên mơi trường Baird-Parkersau khi ủ 35oC/48h.
+ Thử nghiệm Coagulase: dương tính
Chuẩn bị mẫu
-Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vơ trùngcho tới khi được thể đồng .
-Nếu mẫu thử đơng phải làm tan băng trước khi làm xét nghiệm.
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1
Cân chính xác 45g mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị hoặc hút chính xác 45 ml mẫu thực phẩm lỏng cho vào túi nilon vơ trùng (hay cân 10g mẫu thực phẩm/10ml thực phẩm lỏng).Thêm 450 ml nước đệm phosphate (hay 90ml nước đệm phosphate) và đồng nhất mẫu trong vịng 2 phút,thu được dung dịch mẫu thử 10-1
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2, 10-3, 10-4 …
-Hút chính xác 10 ml (hoặc 1ml)dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang chai dural chứa sẵn 90 ml nước đệm phosphate (hoặc ống nghiệm cĩ chhứa sẵn 9 ml nước đệm phosphate), lắc đều,thu được dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử 10-2, 10-3…
Thực hiện: Bước 1: cấy mẫu
- Từ nồng độ pha lỗng ( 10-1, 10-2, 10-3,…), lấy 1ml dung dịch mẫu thử cho sang 3 đĩa thạch Baird-Parker (ví dụ: thể tích mẫu thử cho vào 3 đĩallần lượt là: 0,4, 0,3, 0,3 ml)
+ Riêng với mẫu thực phẩm lỏng: cĩ thể thực hiện như sau: hút trực tiếp 1ml dung dịch mẫu thử nguyên thủy hoặc 1 ml từ các nồng độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3,…cho sang 3 đĩa thạch Baird-Parker (ví dụ: thể tích mẫu thử cho vào 3 đĩa lần lượt là: 0,4, 0,3, 0,3 ml)
- Dùng que cấy vơ trùng, dàn mẫu thử cẩn thận lên mặt đĩa thạch, cố gắng khơng chạm vào mép đĩa. Để các đĩa cĩ nắp đậy cho đến khơ trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phịng. Nếu các đĩa này chưa khơ thì cĩ thể đặt các đĩa (khơng lật ngược đĩa) vào tủ ủ 1h
- Lật ngược các đĩa, ủ trong tủ ấm ở 35 0C trong 24-48 h.
Bước 2: Đếm và nhận định khuẩn lạc điển hình của S.aureus trên mơi trường thạch Baird-Parker
- Đếm và đánh dấu vị trí các khuẩn lạc điển hình của S.aureus trên mơi trường thạch Baird-Parker : Khuẩn lạc trịn, nhẵn, lồi, ướt, đường kính 2-3 mm màu xám đến đen nhánh; và thường được bao quanh bởi một vịng sang hoặc vịng sang đục.
- Chọn các đĩa thạch Baird-Parker cĩ số khuẩn lạc điển hình từ 20 – 200 ( lưu ý: vẫn chấp nhận chọn các đĩa thạch của nồng độ pha lỗng thấp nhất cĩ sơd khuẩn lạc < 20).
- Nếu trên mỗi đĩa thạch Baird-Parker cĩ xuất hiện một số dạng khuẩn lạc nghi ngờ là S.aureus thì đếm riêng rẽ số khuẩn lạc của mỗi dạng.
- Nếu trên các đĩa cĩ xuất hiện > 200 khuẩn lạc điển hình của S.aureus và các khuẩn lạc điển hình khơng cĩ ở những nồng độ pha lỗng cao nhất thì sử dụng các đĩa này để định lượng S.aureus mà khơng cần đếm các khuẩn lạc khơng điển hình.
Bước 3: Thử nghiệm coagulase
- Chọn 5 khuẩn lạc của mỗi dạng khuẩn lạc đã chọn đếm ở bước 2 và tiến hành thử nghiệm coagulase như sau:
- Dùng đầu que cấy thẳng vơ trùng, cấy chuyển mỗi khuẩn lạc nghi ngờ đã chọn vào mỗi ống nghiệm cĩ chứa sẵn 0,2 ml mơi trường canh thang BHI và đồng thời cấy ria lên mỗi ống thạch nghiêng của mơi trường bảo quản chủng như TSA hoặc Nutrient agar …Ử ấm ở 35oC/ 18-24h.
+ Thêm 0,5 ml huyết tương thỏ đã hồn nguyên vào mỗi ống dịch nuơi cấy BHI, lắc đều. Ử ấm 35o và kiểm tra sự đơng tụ của huyết tương sau mỗi giờ, 6 giờ. Sự đơng tụ huyết tương ở bất cứ mức độ nào cũng được xem là phản ứng dương tính. Những cục đơng tụ huyết tương nhỏ hoặc yếu cĩ thể quan sát bằng cách nghiêng nhẹ ống nghiệm để cho phần dung dịch của hỗn hợp phản ứng đến gần phía miệng ống nghiệm, cịnnhững cục đơng tụ huyết tương sẽ nhơ ra ở trên bề mặt dung dịch.
+ Kiểm tra lại các kết quả thử nghiệm coagulase của dịch nuơi cấy BHI trong khoảng thời gian > 18h nhưng < 48h ở 350C.
+ Cần thực hiện đồng tời các thử nghiệm chứng âm và chứng dương cho thử nghiệm coagulase.
- Những ống dịch nuơi cấy BHI cĩ thử nghiệm coagulase dương tính được coi là S.aureus.
Bước 4: Tính tốn và báo cáo kết quả
+ Tính tốn số khuẩn lạc A trên mỗi đĩa thạch Baird-Parker cho keets quả thử nghiệm coagulase dương tính theo cơng thức sau:
A= BCCC / Ac +BncCnc /Anc Trong đĩ:
Ac là số khuẩn lạc điển hình đem thử phản ứng coagulase.
BC là số khuẩn lạc điển hình đem thử phản ứng coagulase dương tính CC là tổng số khuẩn lạc điển hình thấy trên đĩa
Anc số khuẩn lạc khơng điển hình đem thử phản ứng coagulase.
Bnc số khuẩn lạc khơng điển hình đem thử phản ứng coagulase dương tính Cnc là tổng số khuẩn lạc khơng điển hình thấy trên đĩa
Lấy kết quả trịn số
+ Tính số lượng vi khuẩn S.aureus (N) cĩ mặt trong 1g hoặc 1 ml mẫu thử theo cơng thức
N =
Trong đĩ: là tổng số khuẩn lạc cho kết quả thử nghiệm coagulase dương tính trên 3 đĩa đã chọn
d: độ pha lỗng của 3 đĩa đã chọn