4.1.2.1. Khả năng lên men sinh acetone của các mẫu
Mẫu được tăng sinh trên môi trường T6 có bổ sung sodium thioglycolate và parafin, ủ 37oC trong 5 ngày với glucose là cơ chất lên men. 1 ml dịch sau ly tâm phản ứng với 0.5 ml sodium nitroprusiate và 0.5 ml ammonium hydroxide cho thử
nghiệm sinh acetone. Kết quả sau 5 phút nếu có sự đổi màu so với ống chứng âm thì mẫu đó có khả năng chứa vi khuẩn sinh acetone. Kết quả, tất cả các mẫu đều có màu
đậm hơn ống đối chứng.
Hình 4.6. Thử nghiệm khả năng sinh acetone của mẫu phân bò
(-): chứng âm
Mục đích của thử nghiệm này là đánh giá khả năng có mặt của vi khuẩn sinh
dung môi trong các mẫu thu thập từ nhiều địa điểm. Kết quả, 20 mẫu này đều có khả năng chứa vi khuẩn sinh acetone chứng tỏ chúng có thể chứa vi khuẩn sinh dung
môi.
4.1.2.2. Khả năng lên men sinh acetone của các chủng
Qua thử nghiệm catalase, 21 chủng vi khuẩn kị khí được chọn lọc để thử
nghiệm khả năng lên men sinh dung môi.
Các khuẩn lạc được nuôi trong môi trường T6 tương tự như mẫu. 1 ml dịch sau
ly tâm phản ứng lần lượt với hai thuốc thử trên cho kết quả dương tính đối với tất cả
các chủng.
Hình 4.7. Thử nghiệm khả năng sinh acetone của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất mía và đất trồng lúa.
(-): chứng âm
21 chủng kiểm tra đều có khả năng sinh acetone. Điều đó chứng tỏ các chủng này đều có khả năng sinh dung môi.
Như vậy, các mẫu thu thập đều có màu đậm hơn mẫu đối chứng. Điều đó
chứng tỏ khả năng vi khuẩn sinh dung môi có trong mẫu cao. Cụ thể, 21 chủng vi
khuẩn chọn lọc đều có khả năng sinh dung môi.
4.1.3. Nhuộm Gram và nhuộm bào tử
Sau thử nghiệm khả năng sinh acetone, khuẩn lạc của 21 chủng chọn lọc được
cấy ria vào đĩa môi trường RCM – agar sau đó ủ 3 ngày ở 37oC trong điều kiện kị
khí. Kết quả quan sát hình dạng, kích thước và vị trí bào tử được trình bày ở Bảng
4.3. (-) R5 R4 R1 M3 M2 M1
Bảng 4.3. Hình dạng, kích thước và vị trí bào tử của 21 chủng vi khuẩn phân lập
Kí hiệu chủng Gram Hình dạng tế bào Kích thước tế bào sinh dưỡng
(µm) Kích thước tế bào có bào tử (µm) Kích thước bào tử (µm) Vị trí bào tử M1 + Que 74.21 x19.02 73.97 x 23.01 32.27 x 20.25 ở gần đầu tế bào M2 + Que 80.76 x 12.95 78.65 x 15.63 30.52 x 15.19 ở giữa tế bào M3 + Que 86.30 x 13.78 82.30 x 15.21 40.33 x 15.10 ở đầu tế bào R1 + Que 62.77 x 8.01 58.60 x 14.73 20.39 x 14.70 ở gần đầu tế bào R4 + Que 54.89 x 9.76 50.94 x 15.26 22.57 x 15.20 ở gần đầu tế bào R5 + Que 45.38 x 8.40 42.38 x 14.89 16.52 x 14.87 ở đầu tế bào B1 + Que 96.08 x 17.26 Không hình thành bào tử B2 + Que 137.98 x 12.95 125.38x16.76 47.65 x 16.70 ở đầu tế bào B3 - Que (_) P1 + Que 92.38 x 17.31 87.25 x 21.63 42.10 x 21.59 ở giữa tế bào P2 - Que (_) P3 + Que 142.23 x 10.85 117.39x16.28 39.81 x 16.23 ở giữa tế bào P4 + Que 86.79 x 20.96 80.23 x 26.19 41.68 x 26.05 ở gần đầu tế bào P5 + Que 96.14 x 13.68 Không hình thành bào tử P6 + Que 66.89 x 7.44 87.50 x 22.69 40.07 x 22.06 ở đầu tế bào P7 + Cầu (_) N1 - Cầu (_) N2 + Que 105.45 x 31.65 94.14 x 37.88 45.30 x 37.60 ở gần đầu tế bào N3 + Que 77.09 x 16.33 68.91 x 21.03 28.12 x 19.07 ở giữa tế bào N4 + Que 140.51 x 20.13 136.35x26.87 43.70 x 26.53 ở gần đầu tế bào N5 - Que (_)
+ Vi khuẩn gram dương
Kết quả 16 chủng được đánh giá là vi khuẩn hình que, gram dương với 2
chủng không có khả năng hình thành bào tử. Như vậy, 14 chủng trực khuẩn, gram dương, sinh nội bào tử, vị trí bào tử ở giữa, ở đầu hoặc gần đầu tế bào mẹ được chọn
lọc để thực hiện các thử nghiệm sinh hoá tiếp theo.
Hình 4.8. Vi khuẩn gram dương, hình que M1
Hình 4.9. Bào tử hình thành của mẫu M1
Chủng M1 có dạng hình que, bắt màu tím sau khi nhuộm Gram nên nó là vi khuẩn gram dương (Hình 4.8). Chủng này có bào tử ở gần đầu tế bào, bắt màu xanh lục, tế bào vi khuẩn có màu hồng nhạt (Hình 4.9).
4.1.4. Các thử nghiệm sinh hoá 4.1.4.1. Thử nghiệm đông tụ sữa 4.1.4.1. Thử nghiệm đông tụ sữa
14 chủng vi khuẩn chọn lọc được cho vào môi trường sữa có bổ sung resazurin, ủ 37oC trong 24 giờ. Kết quả cho thấy hiện tượng đông tụ sữa diễn ra ở tất cả các chủng.
M1
Hình 4.10. Hiện tượng đông tụ sữa ở các chủng chọn lọc
Quan sát Hình 4.10 ta thấy sữa hình thành cục đông sau 24 giờ ở các chủng P3,
P4, P6, N2, N3, N4. Resazurin từ màu hồng được chuyển sang không màu cho thấy
sự vắng mặt oxy hoàn toàn. Điều đó chứng tỏ điều kiện kị khí được đảm bảo. Các
chủng này được chọn lọc để thực hiện thử nghiệm khả năng lên men một số loại đường.
4.1.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men đường
14 chủng chọn lọc được cấy vào môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth và ủ ở 37oC trong vòng 18 – 20 giờ với cơ chất lên men lần lượt là đường mannitol,
mantose, saccharose, lactose và glucose.
Kết quả thử nghiệm khả năng lên men đường được thể hiện ở Bảng 4.4.
(-)
Bảng 4.4. Kết quả thử nghiệm khả năng lên men đường
Kí hiệu
chủng Mannitol Mantose Saccharose Lactose Glucose
M1 + + + + + M2 - - + - - M3 + + + + + R1 + + + + + R4 + - + - + R5 + + + + + B2 + + + + + P1 - - - - - P3 + + + + + P4 - - - - - P6 + + + + + N2 + + + + + N3 + + + - + N4 + + + + +
Hình 4.11. Thử nghiệm khả năng lên men đường mannitol của 14 chủng vi khuẩn chọn lọc
Kết quả cho thấy 14 chủng vi khuẩn chọn lọc có khả năng sử dụng cơ chất lên
men khác nhau. Đa số chúng có khả năng sử dụng cả 5 loại đường. Một số chủng có
phạm vi sử dụng cơ chất hẹp như chủng N3 không sử dụng đường lactose, R4 không
sử dụng đường mantose và lactose. Các chủng M2, P1, P4 hầu như không có khả năng lên men đường nên ta loại bỏ. Kết quả, 11 chủng vi khuẩn được chọn lọc để
thử nghiệm indol.
4.1.4.3. Thử nghiệm indol
Khuẩn lạc của 11 chủng vi khuẩn chọn lọc được cấy chuyền vào canh Tryptone, ủ 37oC, 24 giờ. Sau đó, nhỏ 1 ml eter và 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào môi
trường. Kết quả cho thấy 11 chủng vi khuẩn đều dương tính với thử nghiệm indol.
Hình 4.12. Thử nghiệm indol của các chủng vi khuẩn chọn lọc
Có sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường của 11 chủng vi khuẩn. Điều đó chứng tỏ tất cả các chủng vi khuẩn này đều có khả năng sinh indol. Một số chủng như R1, P6, N4 cũng có khả năng sinh indol nhưng kém hơn chủng đối chứng do có màu đỏ nhạt, là tiền chất của indol. Các chủng này được chọn lọc để thử nghiệm khử
sulphite.
4.1.4.4. Thử nghiệm khử sulphite
Các khuẩn lạc được nuôi trong môi trường RCM có bổ sung natri thioglycolate
và parafin, ủ 37oC trong 5 ngày. Sau đó, dịch mẫu được pha loãng đến nồng độ 10-2 trước khi đổ đĩa. Môi trường ISA được đổ đĩa hai lần nhằm mục đích tạo điều kiện kị
(+) M1 (-) B2 P3 P6 N2 N3 N4 R5 R4 M2 R1
khí. Các đĩa petri được đặt trong bình kín có chứa túi kị khí Anaerocult®C tạo điều
kiện kị khí. Kết quả cho thấy có 8 chủng vi khuẩn có khả năng khử sulphite là M1, R1, R5, B2, P3, P6, N2, N4.
Hình 4.13. Khuẩn lạc và môi trường màu đen của chủng B2
Thử nghiệm khử sulphite là một thử nghiệm đặc biệt hầu hết được sử dụng để
kiểm tra sự hiện diện của Clostridium trong thực phẩm. Kết quả cho thấy hầu hết các
chủng chuyển môi trường thành màu đen như M1, R5, B2, P3, P6, N2. Chủng R1 và N4 tạo khuẩn lạc đen. Chủng B2 vừa chuyển môi trường sang màu đen vừa tạo
khuẩn lạc đen. 8 chủng này được chọn lọc để thử nghiệm Rifampicin.
4.1.4.5. Thử nghiệm Rifampicin
Sau khi nuôi các chủng trên môi trường RCM, dịch mẫu được trải trên môi
trường RCM – agar. Đặt giấy lọc chứa 5 mg Rifampicin lên bề mặt agar chứa khuẩn
lạc sau khi trải, ủ ở 37oC, 3 ngày ở điều kiện kị khí. Kết quả cho thấy có 6 chủng vi
khuẩn bị ức chế bởi Rifampicin là M1, R5, B2, P6, N2, N4.
Hình 4.14. Vòng ức chế sự phát triển của chủng B2 B2
Rifampicin là một loại kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi
khuẩn gram dương. Dựa vào vòng ức chế, 6 chủng vi khuẩn này được chọn lọc.
Kết quả 6 chủng gram dương, hình thành bào tử, hình que, kị khí, catalase (-), sinh dung môi từ glucose, đông tụ sữa, có khả năng lên men một số loại đường, thủy
phân indol, khử sulfite và bị ức chế bởi Rifampicin. Những chủng này thuộc giống
Clostridium.
4.2. Thảo luận
Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và sàng lọc clostridia sinh dung môi phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nhiên liệu sinh học. Bước đầu, 27 chủng
vi khuẩn được phân lập từ 20 mẫu thu thập, sau đó chọn lọc các chủng clostridia
sinh dung môi và thực hiện một số thử nghiệm sinh hoá cần thiết cho quá trình chọn
lọc clostridia.
Vi khuẩn kị khí được làm thuần từ 20 mẫu lấy từ các địa điểm khác nhau.
Mẫu được tăng sinh trên môi trường T6 có bổ sung natri thioglycolate và parafin hay dầu khoáng. Những mẫu đục và sinh hơi sau 24 giờ là nguồn phân lập vi khuẩn sinh
dung môi tốt hơn những mẫu đục và sinh hơi sau 48 giờ.
Khuẩn lạc đơn được phân lập bằng cách trải và ria trên môi trường RCM –
agar, trong điều kiện kị khí bắt buộc. Hình thái khuẩn lạc đặc trưng là hình tròn, màu
đục, tâm lồi, kết cấu nhầy, kích thước từ 2 – 4 mm và nặng mùi. Từ 20 mẫu thu thập, chúng tôi đã phân lập được 27 chủng vi khuẩn. Bằng thử nghiệm catalase, 21 chủng
kị khí được chọn lọc. Do không có hệ thống enzyme khử độc nên chúng không thể
sống trong điều kiện môi trường có oxy. Vi khuẩn kị khí sinh dung môi có mặt trong
mẫu nước thải và phân bò nhiều hơn so với mẫu đất.
Do không đủ trang thiết bị máy móc và điều kiện thí nghiệm cũng như thời
gian làm luận văn nên việc kiểm tra các sản phẩm lên men bằng sắc kí lỏng cao áp được thay thế bằng thử nghiệm định tính acetone trong môi trường lên men T6. Theo những nghiên cứu trước đây, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn kị khí
chuyển hóa carbonhydrate theo con đường EMP, sinh tổng hợp acetone thì cũng có
thể có khả năng sinh butanol và ethanol. Do đó, dựa vào thử nghiệm acetone, 21
chủng vi khuẩn kị khí phân lập được đều có khả năng lên men sinh acetone chứng tỏ
những chủng này có khả năng lên men sinh butanol và ethanol đồng thời các mẫu
Từ kết quả nhuộm Gram và nhuộm bào tử cho thấy có 14 chủng là trực khuẩn, gram dương, sinh nội bào tử, vị trí bào tử ở giữa, đầu hoặc gần đầu của tế bào mẹ. So sánh kích thước của tế bào có bào tử và tế bào sinh dưỡng, bào tử làm căng
phồng tế bào mẹ dẫn đến kích thước đường kính tế bào lớn hơn so với kích thước
của tế bào sinh dưỡng.
Chính vì vậy mà 14 chủng này được chọn là chủng tiềm năng nhất để tiến hành
các bước sinh hóa xác định vi khuẩn clostridia. Qua các thử nghiệm sinh hóa như
khả năng đông tụ sữa, khả năng sử dụng đường, thủy phân indol, khử sulphite, ức
chế bởi Rifampicin, kết quả thu được 6 chủng vi khuẩn thuộc giống Clostridium.
CHƯƠNG V.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Các kết quả đã thực hiện được như sau:
Mẫu đất sau khi thu nhận được xử lý và tiến hành phân lập, chúng tôi thu được 27 chủng trong đó có 21 chủng vi khuẩn kị khí.
Qua thử nghiệm định tính acetone, 21 chủng vi khuẩn đều có khả năng lên men sinh tổng hợp acetone.
Quan sát hình thái tế bào, có 14 chủng vi khuẩn là trực khuẩn, gram dương,
sinh nội bào tử.
Từ 14 chủng trên sau khi tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa như thử
nghiệm đông tụ sữa, khả năng sử dụng một số loại đường, thử nghiệm indol,
khử sulfite và thử nghiệm Rifampicin, 6 chủng vi khuẩn đã được chọn lọc. Chúng tôi có kết luận sơ bộ 6 chủng này thuộc giống Clostridium.
5.2. Đề nghị
Do thời gian làm luận văn có hạn, chúng tôi chỉ thực hiện một số thí nghiệm cơ
bản. Vì vậy, chúng tôi có những đề nghị sau:
Chúng tôi đề nghị cần có thêm thời gian để có thể tiến hành phân lập thêm nhiều mẫu hơn.
Sau khi đã xác định được chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp acetone,
tiến hành định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử theo phương pháp PCR.
Sau đó thực hiện những thí nghiệm xác định khả năng phân giải cellulose để
lên men sinh dung môi của chủng phân lập được.
Tiến hành chạy sắc ký khí để kiểm tra khả năng sinh dung môi của các chủng
phân lập, từ đó chúng ta có thể chọn được chủng ưu thế có tiềm năng sinh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công
nghệ sinh học tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia
TPHCM.
2. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục.
TIẾNG NƯỚC NGOÀI
5. Bahl, H., Durre, P., 2001. Clostridia Biotechnology and Medical Application, p. 49 – 84.
4. Castano, D.M., 2003. Anaerobic, solvent – producing bacteria: Molercular Characterisation, polysaccharolytic activity and agroindustrial waste degradation, p. 23 – 31.
3. Cato, E.P., George, W.L., and Finegold, S.M., 1986. Genus Clostridium Prazmowski 1880 in Bergey’s Manual of Systermatic Bacteriology, Vol.2, p. 1141 - 1200, Williams and Williams, Baltimore.
11. Durre, P., 2009. Practical Handbook of Microbiology. The GenusClostridium. 2nd edition, p. 339 – 350, CRC, Florida.
6. Hippe, H., Andreesen, J.R., and Gottschalk, G., 1992. The genus Clostrium – nonmedical. The prokaryotes. 2nd edition, p. 1800 – 1866, Springe _ Verlag,
New York.
7. Hsu, E.J., and Ordal, Z. J., 1969. Sporulation of C. thermosaccharolyticum.
Appl. Microbiol 18: 958 – 960.
8. Hyun, H.H., Zeikus, J. G, Longin, R., Millet, J., and Ryter, A., 1983. Utrastructure and extreme heat resistance of spores from Clostridium. thermophitic species. J. Bacterriol 156: 1332 – 1337.
9. Morag, E., Bayer, E.A., and Lamed, R., 1990. Relationship of cellulose – degrading enzymes. J. Bacteriol 172: 6098 – 6105.
10. O’ Brien, R.W., and Morris, J.G., 1971. Oxygen and the growth and metabolism of Clostridium acetobutylicum. J. Gen. Microbiol 68: 307 – 318. 12. Setlow, P., and Johnson, E.A., 1997. Spores and their significance. Food Microbiology fundmentals and Fontiers, p. 30 – 65, DC: ASM Press, Washington. 13. Strasdine, G.A, 1972. The role of intracellulase glucan in endogenus fermention and spore maturation in Clostridium. botulinum type E. Can. J. Microbiol 18: 211 – 217.
TÀI LIỆU INTERNET
14. http://timnovate.wordpress.com/2009/06/ 15. http://www.vnexpress.net/GL/The-gioi/Tu-lieu/2009/05/3BA0EAD4/ 16. http://www.superstock.com/stock-photography/Louis+Pasteur 17. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Adam_Prazmowski.jpg 18. http://de.wikiquote.org/wiki/Chaim_Weizmann 19. http://www.cdiff-support.co.uk/ 20. http://en.wikipedia.org/wiki/Wikipedia_talk:Manual_of_Style_(chemistry) 21. http://alternativefuels.about.com/od/thedifferenttypes/a/biobutanol.htm 22. http://www.thecartorialist.com/?m=200712 23. http://www.drgaryseeman.com/resources/arel.php 24. http://scienceray.com/biology/carbohydrates-2/ 25.http://www.ovsclub.com.vn/show_article.php?aid=11229&lg=vn 26. http://www.hoangvi.com/tin-tuc/o-to-xe-hoi-mo-to/5-nhien-lieu-sach-thay-the-