3.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh
Ống nghiệm, đĩa petri, becher, bình erlen, ống đong, ống chuông Durham, eppendorf 1.5 ml, đầu tip...
Đèn cồn, que cấy, que trải.
Bình ủ kị khí, túi kị khí Anaeocult®C.
Màng lọc vô trùng (kích thước lỗ 0.45 µm).
3.2.2. Thiết bị
Các thiết bị phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh
Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, lò vi ba, tủ sấy Prolabo, tủ lạnh, nồi hấp.
Cân kỹ thuật, cân phân tích.
Bể điều nhiệt.
pH kế Apel pH 1299.
Kính hiển vi Leica DMLS, kính hiển vi Nikon Eclipse 80i.
3.2.3. Vật liệu và hóa chất 3.2.3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng Clostridium có khả năng sinh dung môi được phân lập từ các mẫu đất, nước thải và phân bò tại các địa điểm khác nhau như
Bảng 3.1. Các mẫu phân lập
Loại mẫu Địa điểm thu mẫu Ký hiệu mẫu
Đất trồng mía
Nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh MBC
Xã Hữu Thạnh, Long An MHT
Xã Lương Bình, Long An MLB
Xã Lương Hòa, Long An MLH
Đất trồng lúa
Xã Phạm Văn Hai, Bình Chánh RBC
Xã Đức Hòa Hạ, Long An RLA
Bến Lức, Long An RBL
Gò Vấp RGV
Đất bùn ao rau muống
Tân Tạo, Bình Tân BTT
Bình Chiểu, Thủ Đức BBC Long Thành, Đồng Nai BLT Tây Ninh BTN Phân bò Bình Chiểu, Thủ Đức PBC Long Thành, Đồng Nai PLT Tây Ninh PTN
Trại bò trường Đại học Nông Lâm PNL (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nước thải
Nước đầu vào công ty Masan, Bình Dương NTV
Nước đầu ra công ty Masan, Bình Dương NTR
Phân chuồng chưa xử lý, Thủ Đức CXL
Phân chuồng đã xử lý, Thủ Đức PCXL
3.2.3.2. Hóa chất
1. Thuốc nhuộm tím kết tinh
Dung dịch 1: Gentian violet 1 g
Ethanol 96o 10 ml
Dung dịch 2: Phenol 5 g
Nước cất 100 ml
Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 rồi lọc trong bảo quản trong lọ tối màu.
2. Thuốc nhuộm Lugol
Iod tinh thể 1 g
KI 2 g
Nước cất 300 ml
Hòa KI trong 5 ml nước cất cho tan hết rồi cho iod tinh thể vào. Bổ sung nước
cất cho đủ 300 ml sau khi iod tan hết.
Dung dịch 1: Ethanol 96o 10 ml Fuchsin kiềm 0.3 g Dung dịch 2: Phenol kiềm 0.3 g Nước cất 95 ml
Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 lại rồi pha loãng 5 lần trước khi sử dụng.
4. Thuốc nhuộm Lục malachite
Lục malachite 5 g
Nước cất 100 ml
Bảo quản trong lọ tối màu.
5. Thuốc nhuộm Safranin 0.5%
Safranin 0.5 g
Nước cất 100 ml
Bảo quản trong lọ tối màu.
6. Sodium thioglycolate
Sodium thioglycolate 2 g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nước cất 1000 ml
Bảo quản trong tủ lạnh (0 – 5oC).
7. Thuốc thử định tính acetone
Dung dịch 1: 5% sodium nitroprusiate (g/l)
C5FeN6Na2O.2H2O 5.687 g
Nước cất 100 ml
Hòa tan sodium nitroprusiate trong 20 ml nước cất cho tan hết, sau đó bổ sung nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản trong lọ tối màu.
Dung dịch 2: 2% ammonium hydroxide (g/l)
NH4OH 25% 8.79 ml
Nước cất 91.21 ml
Cho 8.79 ml NH4OH 25% vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất cho đủ
100 ml.
8. Thuốc thử Kovac’s
Isoamyl alcohol 150 ml
HCl đậm đặc 50 ml
Hoà tan p – DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ HCl
cho đến khi đủ lượng. Thuốc thử được chứa trong chai màu tối tránh ánh sáng ở 4oC. Có thể thay thế isoamyl alcohol bằng amyl alcohol hoặc butanol.
9. Thuốc thử catalase
Dung dịch H2O2 (hydrogen peroxide) 30%
3.2.3.3. Thành phần các môi trường
Tất cả các môi trường đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và bảo
quản ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Môi trường RCM (Reinforced Clostridia Medium)
RCM broth medium Yeast extract 3 g Casein peptone 10 g Meat extract 10 g Glucose 5 g Starch solude 10 g Sodium chloride 5 g Sodium acetate 3 g L – Cysteine chlorohydrate 0.5 g Nước cất đủ 1000 ml pH: 6.8 +/- 0.1
Môi trường RCM – agar
RCM agar (MERCK) 51 g
Nước cất 1000 ml
Môi trường T6
Glucose (6% g/l) được sử dụng là nguồn carbon cho thí nghiệm sản xuất dung
môi (Kashket and Cao, 1993). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KH2PO4 0.5 g
MgSO4 . 7H2O 0.3 g
FeSO4 . 7H2O 0.01 g
Yeast extract 2 g Tryptone 6 g Cysteine HCl 0.5 g Agar 18 g Glucose 60g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH: 6.5 bằng NaOH.
Nước muối sinh lý
NaCl 8.5g
Nước cất 1000 ml
RCM – glycerol
RCM broth medium 80 ml
Glycerol 20 ml
Môi trường sữa
Sữa tươi 50 ml
Resazurin 0.05 mg
pH: 7.1. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.
Phenol Red Carbohydrate Broth
Trypticase 10 g NaCl 5 g Cao thịt 1 g Phenol Red 0.018 g Nước cất 1000 ml Carbohydrate 10 g
Nguồn carbohydrate có thể là mannitol, mantose, saccharose, lactose hay glucose.
Rót 6 ml môi trường vào các ống nghiệm chứa ống Durham kiểm tra sự lên men. Hấp 110oC trong 10 phút. pH cuối 7.4 +/- 0.2.
Nước Tryptone (Tryptone Water) cho thử nghiệm indol:
Tryptone 20 g
Nước cất 1000 ml
trong 15 phút, pH cuối 7.2 +/- 0.2.
ISA (Iron Sulfite Agar) cho thử nghiệm khử sulfite.
Casein peptone 15 g
Yeast extract 10 g
Sodium sulfite (Na2SO3) 0.5 g
Agar 20 g
Nước cất 980 ml
pH: 6.9 +/- 0.2
Sau khi hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, bổ sung thêm 20 ml dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
FeSO47% (để nguội môi trường đến 50oC rồi mới bổ sung).
3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Quy trình thực hiện 3.3.1. Quy trình thực hiện
3.3.2. Phương pháp
3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Đối với mẫu đất
Đất là cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loài vi sinh vật. Mẫu được lấy từ những vùng đất trồng khô ráo, không lấy mẫu khi đất bị ướt. Mẫu không được lấy ở những vùng đất đã được bón bột cà phê hoặc phân trộn trong vòng 6 tháng. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau của những vùng đất nông nghiệp từ
những địa điểm khác nhau.
Dùng dao hoặc xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu đất ở nhiều độ sâu khác nhau. Đầu tiên, ta cần loại bỏ lớp đất bề mặt dày 2 – 3 cm trên cùng tránh bị xâm
nhiễm bởi các vi sinh vật bên ngoài, sau đó lấy những tảng nguyên vẹn theo độ sâu
của lớp đất nghiên cứu. Chiều dài của tảng đất bằng chiều dày của tảng đất muốn
lấy. Trên diện tích 1 hecta lấy từ 2 – 5 mẫu. Các mẫu đất được trộn đều, sau đó lấy
khoảng 1 kg đất cho vào túi plastic.
Đối với mẫu phân
Mẫu lấy phải khô ráo, không lấy mẫu bị ướt. Dùng dao hoặc xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu. Trên diện tích 1 hecta (hoặc trong một trang trại) lấy từ 2 – 5 mẫu.
Các mẫu được trộn đều, sau đó cho vào túi plastic.
Mẫu (đất hoặc phân) được phơi khô trong vòng một tuần, tán nhuyễn và lọc
qua rây 2mm. Mẫu được bảo quản trong bình hút ẩm.
Đối với mẫu nước thải
Nước thải là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Mẫu lấy từ nước thải của các khu công nghiệp hay từ các trại chăn nuôi. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau từ những địa điểm khác nhau. Dùng ca lấy mẫu và cho vào chai sạch.
pH của các mẫu được xác định sau khi trộn và đồng nhất 1g mẫu (đất và phân bò) hay 1 ml mẫu (nước thải) trong 10 ml nước cất sau 20 phút. [4]
3.3.2.2. Phương pháp phân lập Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Phân lập (Isolation) là công việc tách rời một loại tế bào từ quần thể vi sinh vật sau đó cấy chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở điều
gọi là khuẩn lạc (colony). Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy vào ống môi trường
giữ giống và ủ ở điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành một quần thể mới.
Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng (strain) hoặc ống giống
(culture).
Cách tiến hành:
1g mẫu (đất hoặc phân) hay 1 ml mẫu (nước) được cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường T6 lỏng và ủ ở 70oC trong vòng 10 phút để bất hoạt tế bào sinh
dưỡng, chọn những chủng có khả năng hình thành bào tử.
Ống nghiệm được ủ ở 37oC, 24 giờ trong điều kiện kị khí. Điều kiện kị khí được tạo ra bằng cách bổ sung natri thioglycolate vào môi trường T6 và parafin lỏng được phủ lên bề mặt môi trường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu có sinh hơi và tăng độ đục được tiếp tục ủ ở 37oC, 96 giờ. Kiểm tra thường xuyên sự phát triển và quá trình sinh hơi.
Trước khi trải đĩa, mẫu được ủ ở 80oC trong vòng 10 phút ở bể điều nhiệt để
bất hoạt tế bào sinh dưỡng lần hai.
Pha loãng: Hút 100 l mẫu cho vào eppendorf chứa 900 l dung dịch nước cất vô trùng, được nồng độ 10-1; hút 100 l mẫu nồng độ 10-1cho vào eppendorf chứa 900 l nước cất vô trùng, được nồng độ 10-2; tiếp theo là nồng độ 10-3.
Hút 100 l dịch pha loãng cho vào các đĩa môi trường RCM – agar. Dùng que trải thuỷ tinh vô trùng trải đều cho đến khi mặt thạch khô ráo.
Đặt các đĩa petri trong một bình kín có chứa túi kị khí Anaerocult®C để tạo điều kiện kị khí.
Ủ 37oC trong 3 – 5 ngày. Cấy chuyền và làm thuần chủng:
Cấy chuyền các khuẩn lạc riêng lẻ phân lập được sang các đĩa môi trường tương ứng. Ủ kị khí ở 37oC trong 3 – 5 ngày. Tiếp tục cấy chuyền lên các đĩa môi trường tương ứng đến khi chủng thuần. Sau đó, giống được bảo quản trên thạch nghiêng ở
3.3.2.3. Phương pháp bảo quản chủng phân lập
Bảo quản giống bằng thạch nghiêng
Cấy khuẩn lạc vào môi trường RCM – agar nghiêng. Ủ 3 ngày ở 37oC trong
điều kiện kị khí. Sau đó, ta cho vào tủ lạnh (0 – 5oC). Lặp lại việc cấy chuyền sau 2 – 4 tuần.
Phương pháp lạnh âm
Tế bào clostridia trong dịch nuôi T6 được ly tâm 13000 vòng/phút/3 phút để
loại dịch. Rửa và huyền phù tủa trong nước muối sinh lý. Hút 0.5 ml huyền phù này cho vào eppendorf chứa 0.5 ml môi trường RCM – glycerol vô trùng, trộn đều. Bảo
quản ở -20oC. [4]
3.3.2.4. Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Vi sinh vật hiếu khí thu năng lượng bằng cách hô hấp với oxy là chất nhận điện
tử sau cùng. Catalase thủy phân H2O2, ngăn chặn sự tích tụ H2O2gây độc cho tế bào.
2H2O2 2H2O + O2
Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt.
Thử nghiệmcatalase dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kị khí.
Cách tiến hành:
Thử nghiệm trên phiến kính (lame): Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn
lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh
vật trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
Tiến hành thử nghiệm catalase song song với chứng dương là B. subtillis và chứng âm là C. beijerinckii.
Kết quả:
(+): Có hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra.
(-): Không có sủi bọt khí. [4] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.5. Phương pháp định tính acetone Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Vi sinh vật có khả năng sử dụng glucose, thực hiện quá trình lên men tạo
acetone. Khi acetone gặp thuốc thử sodium nitroprusiate và ammonium hydroxide thì sẽ đổi màu đậm hơn so với ống đối chứng.
Cách tiến hành:
Dịch lên men đem ly tâm để loại bỏ sinh khối. Hút 1ml dịch vi khuẩn cho vào
ống nghiệm, sau đó bổ sung 0.5ml sodium nitroprusiate (5% g/l) và 0.5ml ammonium hydroxide (2% g/l). Lắc đều, để yên trong 10 phút. Quan sát sự đổi màu của dung dịch.
Tiến hành làm ống đối chứng song song với mẫu, thay thế dịch lên men bằng nước cất, sau đó bổ sung 0.5ml sodium nitroprusiate (5% g/l) và 0.5ml ammonium hydroxide (2% g/l). Lắc đều, để yên trong 10 phút.
Quan sát sự khác nhau giữa màu của ống đối chứng và các ống nghiệm có chứa
dịch lên men.
Kết quả:
Ống nghiệm nào có màu đậm hơn so với ống đối chứng: Phản ứng dương tính. Ống nghiệm nào có màu giống với ống đối chứng: Phản ứng âm tính. [4]
3.3.2.6. Phương pháp nhuộm Gram
Thực hiện phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram.
Nguyên tắc:
Nhuộm Gram hay còn gọi là phản ứng Gram (Gram reaction) có vai trò quan trọng trong việc định danh loại vi khuẩn. Dựa vào khả năng bắt màu với thuốc
nhuộm tím kết tinh (Crystal violet) và Lugol, tất cả vi khuẩn chia thành 2 nhóm lớn:
Vi khuẩn gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crystal violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử
bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu.
Vi khuẩn gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lại có nồng độ lipid cao nên khi rửa bằng cồn lớp chất béo bị hòa tan kéo theo màu thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu hồng đỏ với thuốc nhuộm
Fuchsin ziehl.
Cách tiến hành: Chuẩn bị vết bôi:
Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi trên môi trường RCM lên lam kính sạch (nếu
mật độ vi khuẩn quá dày thì có thể pha loãng), dàn đều dịch vi khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Rửa mẫu bằng cồn ethanol 96%, giữ khoảng 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ
từng giọt cồn cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin ziehl, 30 – 60 giây, rửa nước, để khô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong không khí.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính
hiển vi.
Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng đỏ. [1][2]
Hình 3.2. Các bước tiến hành nhuộm Gram [28] 3.3.2.7. Phương pháp nhuộm bào tử
Nguyên tắc:
Bào tử rất khó nhuộm do màng bào tử dày, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Ta
xử lý bằng nhiệt độ để làm tế bào chất dễ bắt màu. Sau đó nhuộm cả tế bào chất và bào tử với thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm
nó với thuốc nhuộm phân biệt khác.
Cách tiến hành:
Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn.
5 phút. Nếu thuốc nhuộm cạn, ta phải bổ sung ngay, rửa nước.
Nhuộm Safranin 0.5% trong khoảng 30 giây.
Rửa nước, làm khô, quan sát với vật kính nhúng dầu.
Kết quả:
Tế bào vi khuẩn bắt màu hồng nhạt, bào tử màu xanh lục. [1][2]
Hình 3.3. Các bước tiến hành nhuộm bào tử 3.2.2.8. Thử nghiệm đông tụ sữa
Nguyên tắc:
Do vi khuẩn sinh dung môi, sản phẩm phụ có acid sẽ làm thay đổi pH của môi trường dẫn đến làm thay đổi cấu trúc casein. Trong sữa có ion Ca2+ sẽ hút các hạt micelle casein mang điện tích âm tạo khối đông tụ.
Cách tiến hành:
Hút 1 ml vi khuẩn cho vào 50 ml môi trường sữa và ủ 37oC trong 24 giờ.
Tiến hành song song với chứng dương là C. beijerinckii.
Kết quả:
(+): Sữa hình thành cục đông sau 24 giờ.
(-): Sữa không hình thành cục đông. [4]
3.2.2.9. Thử nghiệm khả năng lên men đường Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng một nguồn carbon
nhất định nào đó để tăng trưởng. Vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau để tăng trưởng. Các nguồn carbon có thể được chia thành 3 nhóm là đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo hay polysaccharide) và rượu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau để lên men, tùy phương thức lên men, các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau gồm rượu, acid hữu cơ... Trong tất cả các trường
hợp, sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường. Do đó, khả năng lên men dựa
vào sự giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị trong môi trường và sự sinh khí trong môi trường lỏng được bẫy trong ống Durham.