2.4.1. Trong công nghiệp
Ứng dụng chủ yếu của clostridia trong công nghệ sinh học là lên men acetone – butanol – ethanol bởi C. acetobutylicum. Các dung môi này có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghiệp.
2.4.1.1. Acetone
Acetone là dung môi quan trọng được sử dụng nhiều trong các ngành sản xuất
thuốc nổ, tinh luyện dầu hoả, chế tạo chất thơm… Ngoài ra, acetone còn được sử
dụng trong phân tích hoá học và trong nghiên cứu khoa học.
Một lượng lớn acetone được dùng làm dung môi tẩy rửa trong sản xuất sợi thủy
tinh, dung môi lau chùi trong công nghiệp điện tử, là dung môi tẩy nhờn cho len lụa
và là thuốc rửa móng tay.
Nó cũng được sử dụng làm dung môi trong sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm,
trong quá trình chiết và sản xuất phấn không bụi.
Ngoài ra, hơn 70 ngàn tấn acetone được sử dụng trong những ứng dụng nhỏ như
sản xuất những chất chức năng như chất chống oxy hóa, thuốc diệt cỏ.
2.4.1.2. Ethanol
Ethanol là một trong những hợp chất hữu cơ có nhiều ứng dụng nhất: dung môi,
chất sát trùng, thức uống, chất chống đông, chất trung gian để sản xuất những chất hữu cơ khác và đặc biệt là nhiên liệu. Trong đó, ứng dụng chính của ethanol là một
dung môi hòa tan các chất tan trong cồn.
Ethanol có tác dụng sát khuẩn (>10o). Ethanol được sử dụng trong các gel vệ
sinh kháng khuẩn phổ biến nhất ở nồng độ khoảng 62%. Khả năng khử trùng tốt nhất
của ethanol khi nó ở trong dung dịch khoảng 70%.
Ethanol là nguyên liệu thô chủ chốt trong sản xuất dược phẩm. Ethanol được sử
dụng trong cồn thuốc, giúp hấp thu nhanh và hoàn toàn dược chất.
Các loại đồ uống chứa cồn có hương vị khác nhau do có các hợp chất tạo mùi
khác nhau được hòa tan trong nó trong quá trình ủ và nấu rượu.
Ethanol là nguồn nguyên liệu hóa học đa dụng và trong thời gian qua đã được
sử dụng với phạm vi thương mại để tổng hợp hàng loạt các mặt hàng hóa chất với sản lượng lớn như acid acetic, ethyl acetate, ethyl acrylate, ethyl chloride...
Ethanol cũng được sử dụng trong các sản phẩm chống đông lạnh vì nó có điểm đóng băng thấp.
Một số nước nhiệt đới xem ethanol sản xuất từ các nguồn tái sinh là một nguồn
nguyên liệu hóa dầu hấp dẫn.
Ethanol là chất phụ gia để tăng trị số Octane (trị số đo khả năng kích nổ) và giảm khí thải độc hại của xăng. Xăng ở Mỹ được pha ethanol, phổ biến là E10 (hỗn
hợp 10% ethanol và 90% xăng không chì) và E85.
Hình 2.12. Cây xăng E85 ở thành phố Lexington, Mỹ [25][26]
Hình 2.13. Cây xăng với E10 (10% ethanol) ở California [27]
Xu hướng sử dụng E85 tăng nhanh, theo đó, các loại xe “lai” chạy bằng xăng
hoặc ethanol cũng được sản xuất ngày càng nhiều. Hai thứ nhiên liệu này dễ mua và ethanol rẻ hơn 1/3 so với xăng dầu nên rất được thị trường ưa chuộng. [25]
2.4.1.3. Butanol
Butanol xuất hiện trong nhiều loại thực phẩm và đồ uống. Nó được sử dụng làm
hương liệu nhân tạo tại Mỹ, trong kem, rượu Rum, bánh, kẹo…
Butanol được sử dụng phổ biến nhất là chất trung gian sản xuất butyl acetate và các loại ester butanoat khác nhau. Butanol còn là nguyên liệu để tổng hợp butadien trong tổng hợp cao su nhân tạo. Các ester có phân tử lượng thấp như metyl butanoat có mùi thơm dễ chịu nên chủ yếu được dùng làm phụ gia trong thực phẩm và nước hoa.
Bên cạnh đó, butanol còn là nguyên liệu tạo ra dầu bôi trơn và làm dung môi để
trích ly tinh dầu. Butanol cũng là một dung môi rất phổ biến đểhoà tan sơn, chất màu, chất béo.
Trong số các loại nhiên liệu thay thế, butanol sinh học có thể là sự lựa chọn
hoàn hảo. Butanol có thể phối trộn với dầu lửa tốt hơn ethanol. Hơn nữa, butanol có
áp suất bốc hơi nước thấp hơn và chứa năng lượng cao, có thể được trộn với nồng độ cao hơn ethanol. Butanol dễ vận chuyển, tồn trữ và bơm vào bình nguyên liệu của xe.
Nó có thể trộn lẫn với nhiều loại dung môi hữu cơ cơ bản, nhưng chỉ có thể hòa tan
trong nước khoảng 70g/lít. Vì vậy mà nó thuộc loại hóa chất không thể ăn mòn.
Butanol đang có triển vọng sẽ thay thế nguyên liệu xăng dầu truyền thống trong
tương lai. Butanol là một sản phẩm phụ của một số quá trình lên men, trong đó giống
Clostridium cho ra butanol nhiều nhất và các nghiên cứu hiện tại đang trên đường làm
tăng tối đa lượng butanol từ sinh khối.
2.4.2. Trong y học
Độc tố của clostridia được xác nhận có giá trị trong ứng dụng y khoa và mỹ
phẩm. Bobox là thuốc chống nếp nhăn có nguồn gốc từ ngoại độc tố botulinum do vi
khuẩn yếm khí Clostridium botulinum sản sinh ra. Loại thuốc này còn được sử dụng
trong phẫu thuật mắt và não để làm tê liệt các cơ bắp, không cho chúng co giật vì tác dụng chính của Botox là ngăn chặn luồng xung động thần kinh, làm yếu phần cơ mặt dưới lớp da.
Enzyme của clostridia (collagenase từ C. histolyticum) có khả năng điều trị vết thương, cắt bỏ những mô hoại tử, những vết bỏng nặng hay chỗ loét ở da (Brett,
2005).
sống trong điều kiện kị khí, bào tử của chúng chỉ nảy mầm ở điều kiện kị khí hay môi
trường oxy tối thiểu. Do đó, bào tử tiêm vào cơ thể được máu mang đi trong vòng vài
ngày (Brown và Liu, 2004). Do môi trường của những dịch khối u trong động vật có
vú thì thiếu oxy nên bào tử đi đến nhiều vùng để nảy mầm, tạo thành tế bào sinh
dưỡng và có thể nhân lên trong vùng đó. Vi khuẩn chỉ sinh sôi trong những mô bị
hoại tử. Tập hợp các bào tử sẽ làm tăng tập đoàn clostridia. Chúng có thể sản xuất các protein đặc biệt ở khối u như cystocine, deaminase và nitroreductase. Khi tiêm vào
máu, chúng có khả năng kháng ung thư và chỉ tác động lên khối u (Minton, 2003).
Những nghiên cứu hoạt tính kháng khối u là yếu tố α gây chết khối u (TNFα) (Van
Mellaut etal, 2005) và đặc biệt cho xử lý ung thư tuyến tụy do độc tố ruột C. pefringens (CPE) gây ra (Durre, 2007).
2.4.3. Trong nông nghiệp
Một số loài Clostridium (điển hình nhất là C. pasteurianum) có khả năng cố định nitrogen không khí. Chúng có ý nghĩa rất tích cực đối với việc làm nâng cao dự
trữ đạm của đất. C. pasteurianum có khả năng phân giải cellulose tạo ra nguồn năng lượng cung cấp cho các vi sinh vật khác có điều kiện phát triển và làm giàu thêm độ
xốp của đất. Nó chuyển hoá các chất khó hoà tan thành dạng dễ tan để cho cây trồng
có thể hấp thụ được.
Vi khuẩn Clostridium đồng hóa tốt tất cả các nguồn thức ăn nitơ vô cơ và hữu cơ, cứ 1 gam đường glucose thì đồng hóa được 5 – 12 mg N.
CHƯƠNG III.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 9 đến tháng 12/2009 tại phòng Vi sinh
Ứng dụng thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới.
3.2. Vật liệu và thiết bị 3.2.1. Dụng cụ 3.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh
Ống nghiệm, đĩa petri, becher, bình erlen, ống đong, ống chuông Durham, eppendorf 1.5 ml, đầu tip...
Đèn cồn, que cấy, que trải.
Bình ủ kị khí, túi kị khí Anaeocult®C.
Màng lọc vô trùng (kích thước lỗ 0.45 µm).
3.2.2. Thiết bị
Các thiết bị phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh
Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, lò vi ba, tủ sấy Prolabo, tủ lạnh, nồi hấp.
Cân kỹ thuật, cân phân tích.
Bể điều nhiệt.
pH kế Apel pH 1299.
Kính hiển vi Leica DMLS, kính hiển vi Nikon Eclipse 80i.
3.2.3. Vật liệu và hóa chất 3.2.3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng Clostridium có khả năng sinh dung môi được phân lập từ các mẫu đất, nước thải và phân bò tại các địa điểm khác nhau như
Bảng 3.1. Các mẫu phân lập
Loại mẫu Địa điểm thu mẫu Ký hiệu mẫu
Đất trồng mía
Nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh MBC
Xã Hữu Thạnh, Long An MHT
Xã Lương Bình, Long An MLB
Xã Lương Hòa, Long An MLH
Đất trồng lúa
Xã Phạm Văn Hai, Bình Chánh RBC
Xã Đức Hòa Hạ, Long An RLA
Bến Lức, Long An RBL
Gò Vấp RGV
Đất bùn ao rau muống
Tân Tạo, Bình Tân BTT
Bình Chiểu, Thủ Đức BBC Long Thành, Đồng Nai BLT Tây Ninh BTN Phân bò Bình Chiểu, Thủ Đức PBC Long Thành, Đồng Nai PLT Tây Ninh PTN
Trại bò trường Đại học Nông Lâm PNL
Nước thải
Nước đầu vào công ty Masan, Bình Dương NTV
Nước đầu ra công ty Masan, Bình Dương NTR
Phân chuồng chưa xử lý, Thủ Đức CXL
Phân chuồng đã xử lý, Thủ Đức PCXL
3.2.3.2. Hóa chất
1. Thuốc nhuộm tím kết tinh
Dung dịch 1: Gentian violet 1 g
Ethanol 96o 10 ml
Dung dịch 2: Phenol 5 g
Nước cất 100 ml
Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 rồi lọc trong bảo quản trong lọ tối màu.
2. Thuốc nhuộm Lugol
Iod tinh thể 1 g
KI 2 g
Nước cất 300 ml
Hòa KI trong 5 ml nước cất cho tan hết rồi cho iod tinh thể vào. Bổ sung nước
cất cho đủ 300 ml sau khi iod tan hết.
Dung dịch 1: Ethanol 96o 10 ml Fuchsin kiềm 0.3 g Dung dịch 2: Phenol kiềm 0.3 g Nước cất 95 ml
Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 lại rồi pha loãng 5 lần trước khi sử dụng.
4. Thuốc nhuộm Lục malachite
Lục malachite 5 g
Nước cất 100 ml
Bảo quản trong lọ tối màu.
5. Thuốc nhuộm Safranin 0.5%
Safranin 0.5 g
Nước cất 100 ml
Bảo quản trong lọ tối màu.
6. Sodium thioglycolate
Sodium thioglycolate 2 g
Nước cất 1000 ml
Bảo quản trong tủ lạnh (0 – 5oC).
7. Thuốc thử định tính acetone
Dung dịch 1: 5% sodium nitroprusiate (g/l)
C5FeN6Na2O.2H2O 5.687 g
Nước cất 100 ml
Hòa tan sodium nitroprusiate trong 20 ml nước cất cho tan hết, sau đó bổ sung nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản trong lọ tối màu.
Dung dịch 2: 2% ammonium hydroxide (g/l)
NH4OH 25% 8.79 ml
Nước cất 91.21 ml
Cho 8.79 ml NH4OH 25% vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất cho đủ
100 ml.
8. Thuốc thử Kovac’s
Isoamyl alcohol 150 ml
HCl đậm đặc 50 ml
Hoà tan p – DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ HCl
cho đến khi đủ lượng. Thuốc thử được chứa trong chai màu tối tránh ánh sáng ở 4oC. Có thể thay thế isoamyl alcohol bằng amyl alcohol hoặc butanol.
9. Thuốc thử catalase
Dung dịch H2O2 (hydrogen peroxide) 30%
3.2.3.3. Thành phần các môi trường
Tất cả các môi trường đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và bảo
quản ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Môi trường RCM (Reinforced Clostridia Medium)
RCM broth medium Yeast extract 3 g Casein peptone 10 g Meat extract 10 g Glucose 5 g Starch solude 10 g Sodium chloride 5 g Sodium acetate 3 g L – Cysteine chlorohydrate 0.5 g Nước cất đủ 1000 ml pH: 6.8 +/- 0.1
Môi trường RCM – agar
RCM agar (MERCK) 51 g
Nước cất 1000 ml
Môi trường T6
Glucose (6% g/l) được sử dụng là nguồn carbon cho thí nghiệm sản xuất dung
môi (Kashket and Cao, 1993).
KH2PO4 0.5 g
MgSO4 . 7H2O 0.3 g
FeSO4 . 7H2O 0.01 g
Yeast extract 2 g Tryptone 6 g Cysteine HCl 0.5 g Agar 18 g Glucose 60g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH: 6.5 bằng NaOH.
Nước muối sinh lý
NaCl 8.5g
Nước cất 1000 ml
RCM – glycerol
RCM broth medium 80 ml
Glycerol 20 ml
Môi trường sữa
Sữa tươi 50 ml
Resazurin 0.05 mg
pH: 7.1. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.
Phenol Red Carbohydrate Broth
Trypticase 10 g NaCl 5 g Cao thịt 1 g Phenol Red 0.018 g Nước cất 1000 ml Carbohydrate 10 g
Nguồn carbohydrate có thể là mannitol, mantose, saccharose, lactose hay glucose.
Rót 6 ml môi trường vào các ống nghiệm chứa ống Durham kiểm tra sự lên men. Hấp 110oC trong 10 phút. pH cuối 7.4 +/- 0.2.
Nước Tryptone (Tryptone Water) cho thử nghiệm indol:
Tryptone 20 g
Nước cất 1000 ml
trong 15 phút, pH cuối 7.2 +/- 0.2.
ISA (Iron Sulfite Agar) cho thử nghiệm khử sulfite.
Casein peptone 15 g
Yeast extract 10 g
Sodium sulfite (Na2SO3) 0.5 g
Agar 20 g
Nước cất 980 ml
pH: 6.9 +/- 0.2
Sau khi hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, bổ sung thêm 20 ml dung dịch
FeSO47% (để nguội môi trường đến 50oC rồi mới bổ sung).
3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Quy trình thực hiện 3.3.1. Quy trình thực hiện
3.3.2. Phương pháp
3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Đối với mẫu đất
Đất là cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loài vi sinh vật. Mẫu được lấy từ những vùng đất trồng khô ráo, không lấy mẫu khi đất bị ướt. Mẫu không được lấy ở những vùng đất đã được bón bột cà phê hoặc phân trộn trong vòng 6 tháng. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau của những vùng đất nông nghiệp từ
những địa điểm khác nhau.
Dùng dao hoặc xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu đất ở nhiều độ sâu khác nhau. Đầu tiên, ta cần loại bỏ lớp đất bề mặt dày 2 – 3 cm trên cùng tránh bị xâm
nhiễm bởi các vi sinh vật bên ngoài, sau đó lấy những tảng nguyên vẹn theo độ sâu
của lớp đất nghiên cứu. Chiều dài của tảng đất bằng chiều dày của tảng đất muốn
lấy. Trên diện tích 1 hecta lấy từ 2 – 5 mẫu. Các mẫu đất được trộn đều, sau đó lấy
khoảng 1 kg đất cho vào túi plastic.
Đối với mẫu phân
Mẫu lấy phải khô ráo, không lấy mẫu bị ướt. Dùng dao hoặc xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu. Trên diện tích 1 hecta (hoặc trong một trang trại) lấy từ 2 – 5 mẫu.
Các mẫu được trộn đều, sau đó cho vào túi plastic.
Mẫu (đất hoặc phân) được phơi khô trong vòng một tuần, tán nhuyễn và lọc
qua rây 2mm. Mẫu được bảo quản trong bình hút ẩm.
Đối với mẫu nước thải
Nước thải là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Mẫu lấy từ nước thải của các khu công nghiệp hay từ các trại chăn nuôi. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau từ những địa điểm khác nhau. Dùng ca lấy mẫu và cho vào chai sạch.
pH của các mẫu được xác định sau khi trộn và đồng nhất 1g mẫu (đất và phân bò) hay 1 ml mẫu (nước thải) trong 10 ml nước cất sau 20 phút. [4]
3.3.2.2. Phương pháp phân lập Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Phân lập (Isolation) là công việc tách rời một loại tế bào từ quần thể vi sinh vật sau đó cấy chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở điều
gọi là khuẩn lạc (colony). Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy vào ống môi trường
giữ giống và ủ ở điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành một quần thể mới.
Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng (strain) hoặc ống giống
(culture).
Cách tiến hành:
1g mẫu (đất hoặc phân) hay 1 ml mẫu (nước) được cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường T6 lỏng và ủ ở 70oC trong vòng 10 phút để bất hoạt tế bào sinh
dưỡng, chọn những chủng có khả năng hình thành bào tử.
Ống nghiệm được ủ ở 37oC, 24 giờ trong điều kiện kị khí. Điều kiện kị khí được tạo ra bằng cách bổ sung natri thioglycolate vào môi trường T6 và parafin lỏng được phủ lên bề mặt môi trường.
Mẫu có sinh hơi và tăng độ đục được tiếp tục ủ ở 37oC, 96 giờ. Kiểm tra thường xuyên sự phát triển và quá trình sinh hơi.
Trước khi trải đĩa, mẫu được ủ ở 80oC trong vòng 10 phút ở bể điều nhiệt để
bất hoạt tế bào sinh dưỡng lần hai.
Pha loãng: Hút 100 l mẫu cho vào eppendorf chứa 900 l dung dịch nước cất vô trùng, được nồng độ 10-1; hút 100 l mẫu nồng độ 10-1cho vào eppendorf chứa 900 l nước cất vô trùng, được nồng độ 10-2; tiếp theo là nồng độ 10-3.
Hút 100 l dịch pha loãng cho vào các đĩa môi trường RCM – agar. Dùng que