3.3.2. Phương pháp
3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Đối với mẫu đất
Đất là cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loài vi sinh vật. Mẫu được lấy từ những vùng đất trồng khô ráo, không lấy mẫu khi đất bị ướt. Mẫu không được lấy ở những vùng đất đã được bón bột cà phê hoặc phân trộn trong vòng 6 tháng. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau của những vùng đất nông nghiệp từ
những địa điểm khác nhau.
Dùng dao hoặc xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu đất ở nhiều độ sâu khác nhau. Đầu tiên, ta cần loại bỏ lớp đất bề mặt dày 2 – 3 cm trên cùng tránh bị xâm
nhiễm bởi các vi sinh vật bên ngoài, sau đó lấy những tảng nguyên vẹn theo độ sâu
của lớp đất nghiên cứu. Chiều dài của tảng đất bằng chiều dày của tảng đất muốn
lấy. Trên diện tích 1 hecta lấy từ 2 – 5 mẫu. Các mẫu đất được trộn đều, sau đó lấy
khoảng 1 kg đất cho vào túi plastic.
Đối với mẫu phân
Mẫu lấy phải khô ráo, không lấy mẫu bị ướt. Dùng dao hoặc xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu. Trên diện tích 1 hecta (hoặc trong một trang trại) lấy từ 2 – 5 mẫu.
Các mẫu được trộn đều, sau đó cho vào túi plastic.
Mẫu (đất hoặc phân) được phơi khô trong vòng một tuần, tán nhuyễn và lọc
qua rây 2mm. Mẫu được bảo quản trong bình hút ẩm.
Đối với mẫu nước thải
Nước thải là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Mẫu lấy từ nước thải của các khu công nghiệp hay từ các trại chăn nuôi. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau từ những địa điểm khác nhau. Dùng ca lấy mẫu và cho vào chai sạch.
pH của các mẫu được xác định sau khi trộn và đồng nhất 1g mẫu (đất và phân bò) hay 1 ml mẫu (nước thải) trong 10 ml nước cất sau 20 phút. [4]
3.3.2.2. Phương pháp phân lập Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Phân lập (Isolation) là công việc tách rời một loại tế bào từ quần thể vi sinh vật sau đó cấy chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở điều
gọi là khuẩn lạc (colony). Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy vào ống môi trường
giữ giống và ủ ở điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành một quần thể mới.
Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng (strain) hoặc ống giống
(culture).
Cách tiến hành:
1g mẫu (đất hoặc phân) hay 1 ml mẫu (nước) được cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường T6 lỏng và ủ ở 70oC trong vòng 10 phút để bất hoạt tế bào sinh
dưỡng, chọn những chủng có khả năng hình thành bào tử.
Ống nghiệm được ủ ở 37oC, 24 giờ trong điều kiện kị khí. Điều kiện kị khí được tạo ra bằng cách bổ sung natri thioglycolate vào môi trường T6 và parafin lỏng được phủ lên bề mặt môi trường.
Mẫu có sinh hơi và tăng độ đục được tiếp tục ủ ở 37oC, 96 giờ. Kiểm tra thường xuyên sự phát triển và quá trình sinh hơi.
Trước khi trải đĩa, mẫu được ủ ở 80oC trong vòng 10 phút ở bể điều nhiệt để
bất hoạt tế bào sinh dưỡng lần hai.
Pha loãng: Hút 100 l mẫu cho vào eppendorf chứa 900 l dung dịch nước cất vô trùng, được nồng độ 10-1; hút 100 l mẫu nồng độ 10-1cho vào eppendorf chứa 900 l nước cất vô trùng, được nồng độ 10-2; tiếp theo là nồng độ 10-3.
Hút 100 l dịch pha loãng cho vào các đĩa môi trường RCM – agar. Dùng que trải thuỷ tinh vô trùng trải đều cho đến khi mặt thạch khô ráo.
Đặt các đĩa petri trong một bình kín có chứa túi kị khí Anaerocult®C để tạo điều kiện kị khí.
Ủ 37oC trong 3 – 5 ngày. Cấy chuyền và làm thuần chủng:
Cấy chuyền các khuẩn lạc riêng lẻ phân lập được sang các đĩa môi trường tương ứng. Ủ kị khí ở 37oC trong 3 – 5 ngày. Tiếp tục cấy chuyền lên các đĩa môi trường tương ứng đến khi chủng thuần. Sau đó, giống được bảo quản trên thạch nghiêng ở
3.3.2.3. Phương pháp bảo quản chủng phân lập
Bảo quản giống bằng thạch nghiêng
Cấy khuẩn lạc vào môi trường RCM – agar nghiêng. Ủ 3 ngày ở 37oC trong
điều kiện kị khí. Sau đó, ta cho vào tủ lạnh (0 – 5oC). Lặp lại việc cấy chuyền sau 2 – 4 tuần.
Phương pháp lạnh âm
Tế bào clostridia trong dịch nuôi T6 được ly tâm 13000 vòng/phút/3 phút để
loại dịch. Rửa và huyền phù tủa trong nước muối sinh lý. Hút 0.5 ml huyền phù này cho vào eppendorf chứa 0.5 ml môi trường RCM – glycerol vô trùng, trộn đều. Bảo
quản ở -20oC. [4]
3.3.2.4. Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Vi sinh vật hiếu khí thu năng lượng bằng cách hô hấp với oxy là chất nhận điện
tử sau cùng. Catalase thủy phân H2O2, ngăn chặn sự tích tụ H2O2gây độc cho tế bào.
2H2O2 2H2O + O2
Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt.
Thử nghiệmcatalase dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kị khí.
Cách tiến hành:
Thử nghiệm trên phiến kính (lame): Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn
lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh
vật trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
Tiến hành thử nghiệm catalase song song với chứng dương là B. subtillis và chứng âm là C. beijerinckii.
Kết quả:
(+): Có hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra.
(-): Không có sủi bọt khí. [4]
3.3.2.5. Phương pháp định tính acetone Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Vi sinh vật có khả năng sử dụng glucose, thực hiện quá trình lên men tạo
acetone. Khi acetone gặp thuốc thử sodium nitroprusiate và ammonium hydroxide thì sẽ đổi màu đậm hơn so với ống đối chứng.
Cách tiến hành:
Dịch lên men đem ly tâm để loại bỏ sinh khối. Hút 1ml dịch vi khuẩn cho vào
ống nghiệm, sau đó bổ sung 0.5ml sodium nitroprusiate (5% g/l) và 0.5ml ammonium hydroxide (2% g/l). Lắc đều, để yên trong 10 phút. Quan sát sự đổi màu của dung dịch.
Tiến hành làm ống đối chứng song song với mẫu, thay thế dịch lên men bằng nước cất, sau đó bổ sung 0.5ml sodium nitroprusiate (5% g/l) và 0.5ml ammonium hydroxide (2% g/l). Lắc đều, để yên trong 10 phút.
Quan sát sự khác nhau giữa màu của ống đối chứng và các ống nghiệm có chứa
dịch lên men.
Kết quả:
Ống nghiệm nào có màu đậm hơn so với ống đối chứng: Phản ứng dương tính. Ống nghiệm nào có màu giống với ống đối chứng: Phản ứng âm tính. [4]
3.3.2.6. Phương pháp nhuộm Gram
Thực hiện phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram.
Nguyên tắc:
Nhuộm Gram hay còn gọi là phản ứng Gram (Gram reaction) có vai trò quan trọng trong việc định danh loại vi khuẩn. Dựa vào khả năng bắt màu với thuốc
nhuộm tím kết tinh (Crystal violet) và Lugol, tất cả vi khuẩn chia thành 2 nhóm lớn:
Vi khuẩn gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crystal violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử
bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu.
Vi khuẩn gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lại có nồng độ lipid cao nên khi rửa bằng cồn lớp chất béo bị hòa tan kéo theo màu thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu hồng đỏ với thuốc nhuộm
Fuchsin ziehl.
Cách tiến hành: Chuẩn bị vết bôi:
Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi trên môi trường RCM lên lam kính sạch (nếu
mật độ vi khuẩn quá dày thì có thể pha loãng), dàn đều dịch vi khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Rửa mẫu bằng cồn ethanol 96%, giữ khoảng 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ
từng giọt cồn cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin ziehl, 30 – 60 giây, rửa nước, để khô
trong không khí.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính
hiển vi.
Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng đỏ. [1][2]
Hình 3.2. Các bước tiến hành nhuộm Gram [28] 3.3.2.7. Phương pháp nhuộm bào tử
Nguyên tắc:
Bào tử rất khó nhuộm do màng bào tử dày, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Ta
xử lý bằng nhiệt độ để làm tế bào chất dễ bắt màu. Sau đó nhuộm cả tế bào chất và bào tử với thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm
nó với thuốc nhuộm phân biệt khác.
Cách tiến hành:
Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn.
5 phút. Nếu thuốc nhuộm cạn, ta phải bổ sung ngay, rửa nước.
Nhuộm Safranin 0.5% trong khoảng 30 giây.
Rửa nước, làm khô, quan sát với vật kính nhúng dầu.
Kết quả:
Tế bào vi khuẩn bắt màu hồng nhạt, bào tử màu xanh lục. [1][2]
Hình 3.3. Các bước tiến hành nhuộm bào tử 3.2.2.8. Thử nghiệm đông tụ sữa
Nguyên tắc:
Do vi khuẩn sinh dung môi, sản phẩm phụ có acid sẽ làm thay đổi pH của môi trường dẫn đến làm thay đổi cấu trúc casein. Trong sữa có ion Ca2+ sẽ hút các hạt micelle casein mang điện tích âm tạo khối đông tụ.
Cách tiến hành:
Hút 1 ml vi khuẩn cho vào 50 ml môi trường sữa và ủ 37oC trong 24 giờ.
Tiến hành song song với chứng dương là C. beijerinckii.
Kết quả:
(+): Sữa hình thành cục đông sau 24 giờ.
(-): Sữa không hình thành cục đông. [4]
3.2.2.9. Thử nghiệm khả năng lên men đường Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng một nguồn carbon
nhất định nào đó để tăng trưởng. Vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau để tăng trưởng. Các nguồn carbon có thể được chia thành 3 nhóm là đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo hay polysaccharide) và rượu.
Khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau để lên men, tùy phương thức lên men, các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau gồm rượu, acid hữu cơ... Trong tất cả các trường
hợp, sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường. Do đó, khả năng lên men dựa
vào sự giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị trong môi trường và sự sinh khí trong môi trường lỏng được bẫy trong ống Durham.
Cách tiến hành:
Môi trường sử dụng là Phenol Red Broth Base có pH 7.4 với cơ chất lên men lần lượt là đường mannitol, mantose, saccharose, lactose và glucose, chỉ thị pH thường dùng là đỏ phenol, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8.
Môi trường đã bổ sung đường được khử trùng bằng cách hấp 110oC trong 10 phút.
Cấy và ủ 37oC trong 18 – 20 giờ. Tiến hành lên men với chứng dương là C. beijerinckii.
Đọc kết quả:
Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi.
Sinh acid (+): Khi môi trường với chỉ thị đỏ phenol chuyển thành màu vàng.
Ngược lại, nếu môi trường màu đỏ thì sinh acid là (-).
Sinh hơi (+): Khi có bọt khí trong ống Durham. Nếu không có bọt khí thì sinh
hơi (-). [2]
3.3.2.10. Thử nghiệm indol Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Tryptophan là một acid amin có thể bị oxy hoá bởi một số vi sinh vật có hệ
enzyme tryptophanase tạo indol (skatol), sản phẩm trung gian là indolpyruvic acid. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng thuốc thử p – Dimethylaminobenzaldehyde. Nhân pyrol của indol kết hợp với nhân benzen của p – DMABA tạo phức dạng quinone có màu đỏ.
Cách tiến hành:
Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1 mm cấy chuyền vào canh Tryptone, ủ
37oC trong 24 giờ. Nhỏ 1 ml eter vào ống nghiệm để chiết indol. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào để yên vài phút. Tiến hành song song với chứng dương là C. acetobutylicum.
Đọc kết quả:
(+): Có sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường.
(-): Có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt môi trường.
Đôi khi có sự xuất hiện màu cam do skatol là tiền chất methyl hóa của indol tạo
ra. [2]
3.3.2.11. Thử nghiệm sinh H2S Nguyên tắc:
Một số vi khuẩn tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hóa trong điều kiện kị khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine, cystin, methionine và phóng thích H2S. Khí H2S sinh ra tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfate trong môi trường nuôi cấy.
Chất chỉ thị: sulfate sắt II.
Fe2+ + S2- FeS đen.
Cách tiến hành:
Cấy vào đĩa vô trùng 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp (10-2) vào 1
đĩa petri vô trùng.
Đổ 15 ml môi trường ISA đã được ủ ấm 45oC vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên bề mặt khoảng 10 ml ISA. Đĩa đã cấy mẫu được ủ 37oC, 2 ngày trong các bình kị khí.
Tiến hành song song với chứng âm là B. subtillis.
Kết quả:
(+): Khuẩn lạc có màu đen.
3.3.2.12.Thử nghiệm Rifampicin Nguyên tắc:
Kháng sinh khuyếch tán vào môi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định tạo ra
các vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định. Dựa vào vòng ức chế, chủng
vi sinh vật kiểm định được xác định là Clostridium.
Cách tiến hành:
Cấy vi khuẩn vào 3 ml môi trường RCM và ủ 37oC, 5 ngày. Tiến hành trải mẫu lên các đĩa RCM – agar ở nồng độ thích hợp (100). Đặt giấy lọc chứa 5 mg
Rifampicin lên bề mặt agar chứa khuẩn lạc ủ ở 37oC, 3 ngày ở điều kiện kị khí.
Kết quả:
(+): Rifampicin ức chế khuẩn lạc phát triển.
CHƯƠNG IV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả
4.1.1. Phân lập vi sinh vật từ đất, nước thải và phân bò
Đất, nước thải và phân bò được lấy từ nhiều vùng khác nhau. 20 mẫu được chia
làm 5 nhóm như đã nêu ở phần vật liệu. Mẫu sau khi lấy về phòng thí nghiệm được
xử lý như sấy, rây, đo pH. pH của các mẫu được xác định sau khi trộn và đồng nhất
1g mẫu trong 10 ml nước cất sau 20 phút. Kết quả đo pH của các mẫu được trình bày
ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. pH của 4 loại mẫu phân lập
Loại mẫu Ký hiệu mẫu pH pH trung bình
Đất trồng mía MBC 4.83 5.11 MHT 5.19 MLB 6.16 MLH 4.27 Đất trồng lúa RBC 5.08 5.40 RLA 4.81 RBL 5.63 RGV 6.06 Đất bùn ao rau muống BTT 4.81 5.18 BBC 4.42 BLT 6.39 BTN 5.08 Phân bò PBC 7.58 7.27 PLT 7.67 PTN 6.79 PNL 7.03 Nước thải NTV 6.85 7.55 NTR 7.64 CXL 8.07 PCXL 7.64
Mẫu được tăng sinh trên môi trường T6, bổ sung natri thioglycolate và parafin hoặc dầu khoáng.
a. Phân bò b. Đất trồng mía
Hình 4.1. Hiện tượng sinh hơi sau khi ủ mẫu 2 ngày trong môi trường T6 có bổ sung sodium thioglycolate và parafin.
Sau 5 ngày ủ ở 37oC, các mẫu đều có hiện tượng sinh hơi đẩy ống Durham lên
và làm đục môi trường như Hình 4.1. Sau đó, mẫu được ủ ở 80oC, 10 phút trước khi
tiến hành phân lập trên môi trường RCM - agar.
Hình 4.2. Kết quả trải đĩa của mẫu NTV
Sau khi trải đĩa, 27 chủng vi khuẩn được phân lập từ 20 mẫu dựa vào sự khác
biệt về hình thái bên ngoài trong đó có 4 loại khuẩn lạc từ đất trồng mía, có tên gọi
từ M1 đến M4; 6 loại khuẩn lạc từ đất trồng lúa, kí hiệu từ R1 đến R6; 4 loại khuẩn
lạc từ đất bùn ao rau muống; kí hiệu B1 đến B4, 8 loại từ phân bò; kí hiệu P1 đến
P8, 5 loại từ nước thải, kí hiệu N1 đến N5. Bằng thử nghiệm catalase, 21 chủng vi
khuẩn kị khí đã được chọn lọc trừ 6 chủng M4, B4, P8, R2, R3, R6 với thử nghiệm
catalase (+). Hình thái vi khuẩn chủ yếu là hình tròn, màu đục, tâm lồi, kết cấu nhầy, kích thước từ 2 – 4 mm và nặng mùi, cụ thể được mô tả ở Bảng 4.2.