Thực hiện phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram.
Nguyên tắc:
Nhuộm Gram hay còn gọi là phản ứng Gram (Gram reaction) có vai trò quan trọng trong việc định danh loại vi khuẩn. Dựa vào khả năng bắt màu với thuốc
nhuộm tím kết tinh (Crystal violet) và Lugol, tất cả vi khuẩn chia thành 2 nhóm lớn:
Vi khuẩn gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crystal violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử
bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu.
Vi khuẩn gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lại có nồng độ lipid cao nên khi rửa bằng cồn lớp chất béo bị hòa tan kéo theo màu thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu hồng đỏ với thuốc nhuộm
Fuchsin ziehl.
Cách tiến hành: Chuẩn bị vết bôi:
Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi trên môi trường RCM lên lam kính sạch (nếu
mật độ vi khuẩn quá dày thì có thể pha loãng), dàn đều dịch vi khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Rửa mẫu bằng cồn ethanol 96%, giữ khoảng 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ
từng giọt cồn cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin ziehl, 30 – 60 giây, rửa nước, để khô
trong không khí.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính
hiển vi.
Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng đỏ. [1][2]
Hình 3.2. Các bước tiến hành nhuộm Gram [28] 3.3.2.7. Phương pháp nhuộm bào tử
Nguyên tắc:
Bào tử rất khó nhuộm do màng bào tử dày, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Ta
xử lý bằng nhiệt độ để làm tế bào chất dễ bắt màu. Sau đó nhuộm cả tế bào chất và bào tử với thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm
nó với thuốc nhuộm phân biệt khác.
Cách tiến hành:
Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5 phút. Nếu thuốc nhuộm cạn, ta phải bổ sung ngay, rửa nước.
Nhuộm Safranin 0.5% trong khoảng 30 giây.
Rửa nước, làm khô, quan sát với vật kính nhúng dầu.
Kết quả:
Tế bào vi khuẩn bắt màu hồng nhạt, bào tử màu xanh lục. [1][2]
Hình 3.3. Các bước tiến hành nhuộm bào tử 3.2.2.8. Thử nghiệm đông tụ sữa
Nguyên tắc:
Do vi khuẩn sinh dung môi, sản phẩm phụ có acid sẽ làm thay đổi pH của môi trường dẫn đến làm thay đổi cấu trúc casein. Trong sữa có ion Ca2+ sẽ hút các hạt micelle casein mang điện tích âm tạo khối đông tụ.
Cách tiến hành:
Hút 1 ml vi khuẩn cho vào 50 ml môi trường sữa và ủ 37oC trong 24 giờ.
Tiến hành song song với chứng dương là C. beijerinckii.
Kết quả:
(+): Sữa hình thành cục đông sau 24 giờ.
(-): Sữa không hình thành cục đông. [4]
3.2.2.9. Thử nghiệm khả năng lên men đường Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng một nguồn carbon
nhất định nào đó để tăng trưởng. Vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau để tăng trưởng. Các nguồn carbon có thể được chia thành 3 nhóm là đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo hay polysaccharide) và rượu.
Khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau để lên men, tùy phương thức lên men, các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau gồm rượu, acid hữu cơ... Trong tất cả các trường
hợp, sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường. Do đó, khả năng lên men dựa
vào sự giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị trong môi trường và sự sinh khí trong môi trường lỏng được bẫy trong ống Durham.
Cách tiến hành:
Môi trường sử dụng là Phenol Red Broth Base có pH 7.4 với cơ chất lên men lần lượt là đường mannitol, mantose, saccharose, lactose và glucose, chỉ thị pH thường dùng là đỏ phenol, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8.
Môi trường đã bổ sung đường được khử trùng bằng cách hấp 110oC trong 10 phút.
Cấy và ủ 37oC trong 18 – 20 giờ. Tiến hành lên men với chứng dương là C. beijerinckii.
Đọc kết quả:
Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi.
Sinh acid (+): Khi môi trường với chỉ thị đỏ phenol chuyển thành màu vàng.
Ngược lại, nếu môi trường màu đỏ thì sinh acid là (-).
Sinh hơi (+): Khi có bọt khí trong ống Durham. Nếu không có bọt khí thì sinh
hơi (-). [2] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.10. Thử nghiệm indol Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Tryptophan là một acid amin có thể bị oxy hoá bởi một số vi sinh vật có hệ
enzyme tryptophanase tạo indol (skatol), sản phẩm trung gian là indolpyruvic acid. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng thuốc thử p – Dimethylaminobenzaldehyde. Nhân pyrol của indol kết hợp với nhân benzen của p – DMABA tạo phức dạng quinone có màu đỏ.
Cách tiến hành:
Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1 mm cấy chuyền vào canh Tryptone, ủ
37oC trong 24 giờ. Nhỏ 1 ml eter vào ống nghiệm để chiết indol. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào để yên vài phút. Tiến hành song song với chứng dương là C. acetobutylicum.
Đọc kết quả:
(+): Có sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường.
(-): Có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt môi trường.
Đôi khi có sự xuất hiện màu cam do skatol là tiền chất methyl hóa của indol tạo
ra. [2]
3.3.2.11. Thử nghiệm sinh H2S Nguyên tắc:
Một số vi khuẩn tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hóa trong điều kiện kị khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine, cystin, methionine và phóng thích H2S. Khí H2S sinh ra tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfate trong môi trường nuôi cấy.
Chất chỉ thị: sulfate sắt II.
Fe2+ + S2- FeS đen.
Cách tiến hành:
Cấy vào đĩa vô trùng 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp (10-2) vào 1
đĩa petri vô trùng.
Đổ 15 ml môi trường ISA đã được ủ ấm 45oC vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên bề mặt khoảng 10 ml ISA. Đĩa đã cấy mẫu được ủ 37oC, 2 ngày trong các bình kị khí.
Tiến hành song song với chứng âm là B. subtillis.
Kết quả:
(+): Khuẩn lạc có màu đen.
3.3.2.12.Thử nghiệm Rifampicin Nguyên tắc:
Kháng sinh khuyếch tán vào môi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định tạo ra
các vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định. Dựa vào vòng ức chế, chủng
vi sinh vật kiểm định được xác định là Clostridium.
Cách tiến hành:
Cấy vi khuẩn vào 3 ml môi trường RCM và ủ 37oC, 5 ngày. Tiến hành trải mẫu lên các đĩa RCM – agar ở nồng độ thích hợp (100). Đặt giấy lọc chứa 5 mg
Rifampicin lên bề mặt agar chứa khuẩn lạc ủ ở 37oC, 3 ngày ở điều kiện kị khí.
Kết quả: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(+): Rifampicin ức chế khuẩn lạc phát triển.
CHƯƠNG IV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả
4.1.1. Phân lập vi sinh vật từ đất, nước thải và phân bò
Đất, nước thải và phân bò được lấy từ nhiều vùng khác nhau. 20 mẫu được chia
làm 5 nhóm như đã nêu ở phần vật liệu. Mẫu sau khi lấy về phòng thí nghiệm được
xử lý như sấy, rây, đo pH. pH của các mẫu được xác định sau khi trộn và đồng nhất
1g mẫu trong 10 ml nước cất sau 20 phút. Kết quả đo pH của các mẫu được trình bày
ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. pH của 4 loại mẫu phân lập
Loại mẫu Ký hiệu mẫu pH pH trung bình
Đất trồng mía MBC 4.83 5.11 MHT 5.19 MLB 6.16 MLH 4.27 Đất trồng lúa RBC 5.08 5.40 RLA 4.81 RBL 5.63 RGV 6.06 Đất bùn ao rau muống BTT 4.81 5.18 BBC 4.42 BLT 6.39 BTN 5.08 Phân bò PBC 7.58 7.27 PLT 7.67 PTN 6.79 PNL 7.03 Nước thải NTV 6.85 7.55 NTR 7.64 CXL 8.07 PCXL 7.64
Mẫu được tăng sinh trên môi trường T6, bổ sung natri thioglycolate và parafin hoặc dầu khoáng.
a. Phân bò b. Đất trồng mía
Hình 4.1. Hiện tượng sinh hơi sau khi ủ mẫu 2 ngày trong môi trường T6 có bổ sung sodium thioglycolate và parafin.
Sau 5 ngày ủ ở 37oC, các mẫu đều có hiện tượng sinh hơi đẩy ống Durham lên
và làm đục môi trường như Hình 4.1. Sau đó, mẫu được ủ ở 80oC, 10 phút trước khi
tiến hành phân lập trên môi trường RCM - agar.
Hình 4.2. Kết quả trải đĩa của mẫu NTV
Sau khi trải đĩa, 27 chủng vi khuẩn được phân lập từ 20 mẫu dựa vào sự khác
biệt về hình thái bên ngoài trong đó có 4 loại khuẩn lạc từ đất trồng mía, có tên gọi
từ M1 đến M4; 6 loại khuẩn lạc từ đất trồng lúa, kí hiệu từ R1 đến R6; 4 loại khuẩn
lạc từ đất bùn ao rau muống; kí hiệu B1 đến B4, 8 loại từ phân bò; kí hiệu P1 đến
P8, 5 loại từ nước thải, kí hiệu N1 đến N5. Bằng thử nghiệm catalase, 21 chủng vi
khuẩn kị khí đã được chọn lọc trừ 6 chủng M4, B4, P8, R2, R3, R6 với thử nghiệm
catalase (+). Hình thái vi khuẩn chủ yếu là hình tròn, màu đục, tâm lồi, kết cấu nhầy, kích thước từ 2 – 4 mm và nặng mùi, cụ thể được mô tả ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Mô tả hình thái của 21 vi khuẩn kị khí được phân lập từ các mẫu
Vi khuẩn
phân lập Mô tả hình thái (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M1 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu vàng nhạt, tâm lồi, kết cấu nhầy, kích thước 2 – 3 mm
M2 Khuẩn lạc hình bầu dục, bề mặt nhẵn, màu vàng nhạt, tâm đục, xung quanh mờ, kết cấu nhầy, kích thước 2 – 4 mm
M3 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, tâm lồi, màu vàng nhạt, kết cấu nhầy, kích thước 2 – 4 mm
R1 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu vàng nhạt, xung quanh mờ, kích thước 2 – 4 mm
R4 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu trắng, xung quanh mờ, kích thước nhỏ 1.5 – 2 mm
R5 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu trắng, tâm lồi, kết cấu nhầy, kích thước 2 – 3 mm
B1 Khuẩn lạc tròn, bề mặt nhẵn, tâm lồi, màu trắng đục, xung quanh mờ, kích thước lớn 3 – 5 mm
B2 Khuẩn lạc có hình tròn, bề mặt gồ ghề, màu vàng nhạt, tâm lồi, xung quanh mờ, kết cấu nhầy, kích thước 2 – 5 mm
B3 Khuẩn lạc có hình dạng không xác định, bề mặt nhăn, màu vàng nhạt, kích thước 2 – 4 mm
P1 Khuẩn lạc có hình dạng không xác định, bề mặt nhăn, màu hồng nhạt, xung quanh mờ, kích thước 2 – 4 mm
P2 Khuẩn lạc tròn, bề mặt nhẵn, màu trong suốt, tâm đục, cấu trúc nhớt, kích thước 3 – 6 mm
P3 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu trắng, tâm lồi, kích thước nhỏ 1 – 1.5 mm
P4 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu vàng nhạt, tâm lồi, kích thước 1 – 2 mm
P5 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu trắng đục, xung quanh mờ, kích thước 1 – 3 mm
P6 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, xung quanh gồ ghề, màu trắng đục, tâm lồi, kết cấu nhầy,kích thước 1 – 3 mm
P7 Khuẩn lạc tròn, bề mặt nhẵn, tâm lồi, màu trắng đục, kích thước đồng đều 1 – 1.5 mm
N1 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhẵn, màu trắng đục, xung quanh mờ, kích thước 2 – 4 mm
N2 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt nhăn, màu trắng đục, tâm lồi, kết cấu nhầy, kích thước 2 – 3 mm
N3 Khuẩn lạc có hình dạng không xác định, bề mặt gồ ghề, tâm đục, xung quanh mờ màu vàng nhạt, kích thước nhỏ 1 – 1.5 mm
N4 Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt gồ ghề, màu vàng nhạt, kết cấu nhầy, tâm lồi, kích thước 1 – 2 mm
Hình 4.3.
Tiếp tục cấy chuyền lên các đĩa môi trường RCM - agar để làm thuần chủng. Sau đó, các chủng được bảo quản trên thạch nghiêng hay bảo quản bằng phương pháp
lạnh âm ở -20oC.
Hình 4.4. Bảo quản chủng trên thạch nghiêng
Hình 4.5. Bảo quản lạnh âm (-20oC) M1
4.1.2. Thử nghiệm khả năng lên men sinh acetone 4.1.2.1. Khả năng lên men sinh acetone của các mẫu 4.1.2.1. Khả năng lên men sinh acetone của các mẫu
Mẫu được tăng sinh trên môi trường T6 có bổ sung sodium thioglycolate và parafin, ủ 37oC trong 5 ngày với glucose là cơ chất lên men. 1 ml dịch sau ly tâm phản ứng với 0.5 ml sodium nitroprusiate và 0.5 ml ammonium hydroxide cho thử
nghiệm sinh acetone. Kết quả sau 5 phút nếu có sự đổi màu so với ống chứng âm thì mẫu đó có khả năng chứa vi khuẩn sinh acetone. Kết quả, tất cả các mẫu đều có màu
đậm hơn ống đối chứng.
Hình 4.6. Thử nghiệm khả năng sinh acetone của mẫu phân bò (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(-): chứng âm
Mục đích của thử nghiệm này là đánh giá khả năng có mặt của vi khuẩn sinh
dung môi trong các mẫu thu thập từ nhiều địa điểm. Kết quả, 20 mẫu này đều có khả năng chứa vi khuẩn sinh acetone chứng tỏ chúng có thể chứa vi khuẩn sinh dung
môi.
4.1.2.2. Khả năng lên men sinh acetone của các chủng
Qua thử nghiệm catalase, 21 chủng vi khuẩn kị khí được chọn lọc để thử
nghiệm khả năng lên men sinh dung môi.
Các khuẩn lạc được nuôi trong môi trường T6 tương tự như mẫu. 1 ml dịch sau
ly tâm phản ứng lần lượt với hai thuốc thử trên cho kết quả dương tính đối với tất cả
các chủng.
Hình 4.7. Thử nghiệm khả năng sinh acetone của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất mía và đất trồng lúa.
(-): chứng âm
21 chủng kiểm tra đều có khả năng sinh acetone. Điều đó chứng tỏ các chủng này đều có khả năng sinh dung môi.
Như vậy, các mẫu thu thập đều có màu đậm hơn mẫu đối chứng. Điều đó
chứng tỏ khả năng vi khuẩn sinh dung môi có trong mẫu cao. Cụ thể, 21 chủng vi
khuẩn chọn lọc đều có khả năng sinh dung môi.
4.1.3. Nhuộm Gram và nhuộm bào tử
Sau thử nghiệm khả năng sinh acetone, khuẩn lạc của 21 chủng chọn lọc được
cấy ria vào đĩa môi trường RCM – agar sau đó ủ 3 ngày ở 37oC trong điều kiện kị
khí. Kết quả quan sát hình dạng, kích thước và vị trí bào tử được trình bày ở Bảng
4.3. (-) R5 R4 R1 M3 M2 M1
Bảng 4.3. Hình dạng, kích thước và vị trí bào tử của 21 chủng vi khuẩn phân lập
Kí hiệu chủng Gram Hình dạng tế bào Kích thước tế bào sinh dưỡng
(µm) Kích thước tế bào có bào tử (µm) Kích thước bào tử (µm) Vị trí bào tử M1 + Que 74.21 x19.02 73.97 x 23.01 32.27 x 20.25 ở gần đầu tế bào M2 + Que 80.76 x 12.95 78.65 x 15.63 30.52 x 15.19 ở giữa tế bào M3 + Que 86.30 x 13.78 82.30 x 15.21 40.33 x 15.10 ở đầu tế bào R1 + Que 62.77 x 8.01 58.60 x 14.73 20.39 x 14.70 ở gần đầu tế bào R4 + Que 54.89 x 9.76 50.94 x 15.26 22.57 x 15.20 ở gần đầu tế bào R5 + Que 45.38 x 8.40 42.38 x 14.89 16.52 x 14.87 ở đầu tế bào B1 + Que 96.08 x 17.26 Không hình thành bào tử B2 + Que 137.98 x 12.95 125.38x16.76 47.65 x 16.70 ở đầu tế bào B3 - Que (_) P1 + Que 92.38 x 17.31 87.25 x 21.63 42.10 x 21.59 ở giữa tế bào P2 - Que (_) P3 + Que 142.23 x 10.85 117.39x16.28 39.81 x 16.23 ở giữa tế bào P4 + Que 86.79 x 20.96 80.23 x 26.19 41.68 x 26.05 ở gần đầu tế bào P5 + Que 96.14 x 13.68 Không hình thành bào tử P6 + Que 66.89 x 7.44 87.50 x 22.69 40.07 x 22.06 ở đầu tế bào P7 + Cầu (_) N1 - Cầu (_) N2 + Que 105.45 x 31.65 94.14 x 37.88 45.30 x 37.60 ở gần đầu tế bào N3 + Que 77.09 x 16.33 68.91 x 21.03 28.12 x 19.07 ở giữa tế bào N4 + Que 140.51 x 20.13 136.35x26.87 43.70 x 26.53 ở gần đầu