Tách chiết ADN tổng số
Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, mỗi cây lấy 1 lá ở giai đoạn 3 tuần tuổi. Quy trình tách chiết ADN tổng số theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) (Saghai Maroof M. A. et al., 1984).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
- Nghiền mẫu lá tươi trong Nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml, sau đó bổ sung 2 - 3ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 650C), đảo đều mẫu nhẹ nhàng.
- Ủ mẫu ở 650C trong thời gian 45 - 60 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chiết ADN 2 lần với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly tâm mỗi lần ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống eppendorf sang một ống mới.
- Kết tủa ADN với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate, đảo đều ở - 200C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Rửa ADN trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút.
- Làm khô AND, hòa tan ADN trong 100µl dung dịch TE bảo quản ở - 200C.
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch ADN tổng số
Độ tinh sạch và nồng độ của ADN tổng sốđược đo bằng máy đo quang phổ (Ultrospec UV/Visible - 65 spectrophotometer). Nồng độ ADN được tính theo công thức sau:
Nồng độ ADN (µg/ml) = (OD260 x 50 x 50µg/ml)/1000 Trong đó: OD260 là chỉ sốđo được ở bước sóng λ = 260.
50 là hệ số pha loãng. 50µg/ml là hằng số.
Tỷ lệ OD260/OD280 phản ánh độ tinh sạch của mẫu (thường trong khoảng 1,8 - 2,0).
Phản ứng PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction, chạy điện di và nhuộm
mẫu)
- Thành phần của một phản ứng PCR
Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể được thể hiện ở bảng 3.4.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Bảng 3.4. Thành phần của một phản ứng PCR TT Dung dịch gốc Nồng độ sử dụng Thể tích (µl) 1 Nước cất vô trùng - 5,6 2 Đệm PCR 10X 1X 1,0 3 MgCl2 25mM 2,0 mM 0,8 4 4 loại dNTP 0,25mM 1,0
5 Taq DNA polymerase 5U/ul 0,5U 0,1
6 Mồi xuôi 5µM 0,25µM 0,25
7 Mồi ngược 5µM 0,25µM 0,25
8 ADN khuôn 10ηg/µl 10ηg 1,0
Tổng thể tích của một phản ứng 10,0
- Chương trình chạy PCR
Phản ứng PCR được tiến hành trong plate 96 giếng và chạy theo chương trình cụ thểở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Phản ứng Chu trình nhiệt
1 Biến tính đầu tiên 940C trong 2 phút
2 Biến tính 940C trong 30 giây
3 Gắn mồi 560C trong 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 720C trong 1 phút
5 Lặp lại từ bước 2, 29 lần
6 Kéo dài chuỗi cuối cùng 720C trong 5 phút
7 Bảo quản 40C, ∞
Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4µl dung dịch SSS (Sequencing Stop Solution - Bao gồm: 10mM NaOH + 95% formamide + 0,05% bromophenol + 0,05% xylene cyanol).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Các sản phẩm PCR và marker ADN có khối lượng chuẩn (ФX174 ADN/HinfI, 20ηg/µl) được biến tính ở 950C trong 5 phút, sau đó ngay lập tức làm lạnh và giữ trong đá cho đến khi được tra vào bản gel.
Sản phẩm PCR sau khi biến tính và sốc nhiệt trong đá lạnh được đưa vào chạy điện di trên gel polyacrylamide 4,5% ở nhiệt độ 500C.
Gel polyacrylamide bao gồm 60ml polyacrylamide 4,5%, bổ sung thêm 600µl dung dịch APS 10% và 60µl dung dịch TEMED.
Bảng 3.6. Thành phần gel polyacrylamide 4,5% TT Dung dịch gốc Thể tích 1 Acrylamide 40% 6,75ml 2 Ure 25,2g 3 TBE 5X 12ml Tổng thể tích 60ml
- Phương pháp nhuộm bạc đối với gel polyacrylamide
+ Sau khi kết thúc thời gian điện di, cố định tấm kính bám gel bằng dung dịch cốđịnh gel (Glacial acetic acid 10%) trong 20 phút;
+ Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cốđịnh, rửa bằng nước cất hai lần trong 5 phút; + Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút (chuẩn bị dung dịch nhuộm trước bằng cách: hòa tan 1g AgNO3 trong 1 lít nước cất hai lần khử ion, sau đó bổ sung 1,5ml dung dịch formaldehyde 37%);
+ Bản gel được rửa lại bằng nước cất hai lần trong thời gian 5 - 10 giây; + Đưa bản gel vào dung dịch hiện (chuẩn bị trước: hòa tan 30g Na2CO3 trong 1 lít nước cất hai lần khử ion, làm lạnh ở nhiệt độ - 200C. Trước khi dung bổ sung 1,5ml formaldehyde 37% + 200ml sodium thiosulfate 10mg/ml), lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất hiện, sau đó đổ trực tiếp dung dịch cố định (đã dùng ở trên) lên trên bản gel để dừng phản ứng hiện, duy trì trong 4 - 6 phút;
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36