Kỹ thuật đơn bội kép được đề xuất, nghiên cứu ứng dụng nhằm nhanh chóng tạo được các dòng ngô đồng hợp tử hoàn toàn, rút ngắn thời gian tạo giống, tăng hiệu quả chọn lọc trong chọn tạo giống lai. Phương pháp này rất hữu ích cho quá trình xác lập mối quan hệ giữa các vật liệu mà đôi khi còn gặp khó khăn đối cới các nguồn vật liệu mới chưa rõ nguồn gốc.
2.5.2.1. Phương pháp tạo dòng đơn bội kép bằng phương pháp sử dụng dòng kích tạo đơn bội
Dòng kích tạo đơn bội (haploid inducer) là những dòng có khả năng tham gia vào quá trình thụ phấn nhưng không đóng góp bộ nhiễm sắc thể vào việc hình thành hạt, do đó đã tạo thành các hạt đơn bội một cách tự nhiên.
Cây ngô đơn bội đầu tiên đã được Randolph mô tả vào năm 1932 (Randolph L. F., 1932), sau đó nghiên cứu của Chase cho thấy: tần số gây tạo đơn bội tự nhiên ở ngô thấp (khoảng 0,1%) và ông đã dựđoán rằng các dòng đơn bội có thể sử dụng trong nghiên cứu di truyền và tạo giống ngô lai. Tuy nhiên, do tần số tạo hạt đơn bội tự nhiên quá thấp nên không đáp ứng được nhu cầu của các nhà tạo giống. Do đó, rất nhiều tác giảđã nghiên cứu nhằm tìm ra các dòng ngô có tần số tạo cây đơn bội
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
cao, Rober và cs đã thu được tỷ lệ tạo đơn bội đạt 8,1%, cao nhất so với các dòng trước đó (Rober F. K. et al., 2005).
Cho đến nay những cơ chế dẫn đến việc kích tạo đơn bội vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Những nghiên cứu phân tích locus tính trạng số lượng (QTLs) của Rober và cs đã chỉ ra rằng: quá trình kích tạo đơn bội in vivo ở ngô được kiểm soát bởi nhiều gen nằm trên các locus khác nhau (Rober F. K. et al., 2005).
Ưu thế của phương pháp sử dụng dòng mang gen kích tạo đơn bội là rút ngắn thời gian tạo dòng, thu được dòng thuần sau hai thế hệ, ít bị phụ thuộc vào kiểu gen và có thể áp dụng trong điều kiện không có phòng thí nghiệm. Song, việc ứng dụng phương pháp này còn hạn chế do tần suất tự lưỡng bội rất thấp từ 0 – 10%, hơn nữa việc tách hạt đơn bội và hạt lưỡng bội cũng rất khó khăn (Beckert M., 1994).
Ở Việt Nam, trước đây phương pháp sử dụng dòng kích tạo đơn bội trong chọn tạo giống ngô còn hạn chế do các dòng có khả năng tạo hạt đơn bội chủ yếu có nguồn gốc ôn đới. Hiện nay, sau khi các dòng kích tạo đơn bội được nhiệt đới hóa thì phương pháp này cũng được các nhà chọn tạo giống Việt Nam quan tâm ứng dụng.
2.5.2.2. Phương pháp tạo dòng đơn bội kép bằng phương pháp nuôi cấy noãn ngô
Phương pháp tạo dòng ngô đơn bội kép bằng nuôi cấy noãn ngô in vitro đã được nghiên cứu từ đầu những năm 1980 [Andre I., 1981; Ao G. M. et al., 1982). Các tác giảđã nghiên cứu tạo mô sẹo (callus) từ noãn ngô chưa thụ tinh, sau đó tái sinh cây từ callus thu được. Nghiên cứu tạo dòng thuần được tạo ra bằng phương pháp này ở mức phân tử cho thấy cây ngô được tái sinh là do tế bào trứng chưa thu tinh tự lưỡng bội hóa tạo thành. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phụ thuộc rất lớn vào khả năng sinh sản đơn tính cái đại bào tử (megaspore – gynogenesis) của các nguồn vật liệu nuôi cấy. Tỷ lệ phản ứng tạo callus và khả năng tái sinh cây không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen (genotypes) mà còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng, chất lượng của vật liệu cho noãn và kỹ thuật nuôi cấy nên hiệu quả của quá trình nuôi cấy còn thấp. Vì vậy, phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi.
Ở nước ta, nghiên cứu về nuôi cấy noãn ngô cũng đã được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ngô và Viện Di truyền Nông nghiệp. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
vào việc xác định công thức môi trường và nguồn vật liệu cho phản ứng tạo callus và tái sinh cây cao [Bùi Mạnh Cường, 2007; Nguyễn Hữu Đống và cs, 1995; Nguyễn Hữu Đống và cs, 1997).
2.5.2.3. Phương pháp tạo dòng đơn bội kép bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời
Trong nuôi cấy bao phấn, khả năng sinh sản của các thể đơn bội trước hết phụ thuộc vào các phương thức hình thành thể đơn bội và số lượng thể đơn bội. Thông qua kỹ thuật này cho phép tạo ra hàng loạt các cá thểđơn bội kép.
Phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô được Anonymous nghiên cứu từ năm 1975, sau đó được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và hoàn thiện quy trình. Cấu trúc dạng phôi hình thành từ nuôi cấy hạt phấn tách rời cũng đã được nghiên cứu từ cuối những năm 1980 (Pescitelli S. M. et al., 1989). Sự tái sinh thành công cây ngô đơn bội từ tiểu bào tử cũng đã được báo cáo. Những nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời ở ngô có tầm quan trọng rất lớn trong việc tạo ra các dòng thuần (dòng đơn bội kép – double haploid lines) phục vụ công tác tạo giống ngô lai [Buter B. et al., 1994; Goralski G., 2002).
Sự thành công của kỹ thuật nuôi cây bao phấn và hạt phấn tách rời phụ thuộc rất lớn vào khả năng sinh sản đơn tính đực (Androgenesis) của các nguồn vật liệu nuôi cấy. Trong tự nhiên, tần suất sinh sản đơn tính ở ngô khoảng 1/1.0000.000, trong đó sự sinh sản đơn tính đực khoảng 1/80.000 (Chase S. S., 1951). Trong điều kiện in vitro, sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy bao phấn phụ thuộc trước tiên vào sự chọn lọc các kiểu gen, môi trường nuôi cấy, điều kiện sinh trưởng của cây và các biện pháp kỹ thuật tác động. Kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy: khi bào tử phát triển ở một nhân muộn và hai nhân sớm là giai đoạn thích hợp nhất đối với quá trình sinh sản đơn tính in vitro. Ở môi trường cảm ứng, các tiểu bào tử có thể tạo thành callus hoặc tái sinh cây trực tiếp. Tùy vào mục đích và điều kiện thí nghiệm mà sử dụng các phương pháp khác nhau để nâng cao tỷ lệ tái sinh cây.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các yếu tốảnh hưởng tới tỷ lệ tái sinh cây. Chu và cs đã sử dụng môi trường N6 để thay cho môi trường khoáng MS và thu được tỷ lệ phản ứng là 1% nhưng không tái sinh được cây (Chu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
C. C. et al., 1975). Sau đó, nhiều môi trường có thành phần khác nhau đã được các tác giả nghiên cứu và sử dụng như môi trường YP, Zhen 14, 6M, 6N1 (Nitsch C. et al., 1982).
Những nghiên cứu bổ sung nguồn hydratcacbon (đường) vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau cũng nâng cao tỷ lệ tái sinh cây. Kết quả nghiên cứu của Buter, Obert và cs chỉ ra rằng hiệu quả của phản ứng tạo phôi và tái sinh cây cao nhất ở nồng độ đường là 9%. Xử lý nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của các bao phấn nuôi cấy: xử lý lạnh bao phấn trước khi nuôi cấy đã kích thích các tiểu bào tử phát triển tạo phôi; nhiệt độ và thời gian xử lý khác nhau thì hiệu quả thu được cũng khác nhau. Điều kiện sinh trưởng của cây cho bao phấn và mùa vụ cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ phản ứng (Dieu P. and Beckert M., 1986). Ngoài ra, các yếu tố kỹ thuật như pH môi trường, thời gian chiếu sang, kỹ thuật chọn mẫu, phương pháp khử trùng, kỹ thuật và thời gian cấy chuyển… cũng đều ảnh hưởng tới sự phát triển của tiểu bào tửđể tạo phôi và tái sinh cây.
Ở Việt Nam, phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô bắt đầu được nghiên cứu và ứng dụng trong khoảng 15 năm trở lại đây và đã thu được một số kết quả nhất định [Bùi Mạnh Cường và cs, 1998; Lê Huy Hàm và cs, 1998; Lê Huy Hàm và cs, 1999). Những nghiên cứu cải tiến qui trình nuôi cấy nhằm nâng cao tỉ lệ tạo phôi và tái sinh cây cũng đã được đề cập như: xử lý lạnh bao phấn trước và sau khi cấy, cải tiến thành phần muối khoáng trong môi trường nuôi cấy, bổ sung các chất hữu cơ… (Lê Huy Hàm và cs, 1998; Lê Huy Hàm và cs, 1999). Phương pháp truyền tính cảm ứng thông qua lai nguồn có phản ứng cao với vật liệu của Việt Nam đã nâng cao tỷ lệ tái sinh cây lên hàng chục lần. Kết quả nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Ngô giai đoạn 1996 – 1998 cho thấy tỷ lệ phản ứng tạo cấu trúc phôi trung bình chỉđạt 4%, tỷ lệ tái sinh cây khoảng 2,1%, bằng việc cải tiến các nguồn vật liệu đã nâng tỷ lệ này lên tương ứng là 10% và 11%. Đặc biệt đã xác định được một số nguồn vật liệu có tỷ lệ tạo phôi trên 30% và tái sinh cây trên 14%. Hiện nay, hướng nghiên cứu này vẫn được triển khai để tạo dòng có giá trị thương mại (Bùi Mạnh Cường, 2007). Triển vọng và tiềm năng của phương pháp tạo dòng đơn bội kép có tầm quan trọng rất lớn trong công tác chọn tạo giống ngô. Bằng phương pháp này không chỉ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần mà các dòng đơn bội kép tạo ra có thể mang các đặc điểm ưu việt của nguồn vật liệu cho bao phấn nuôi cấy hơn phương pháp tự phối. Các dòng đơn bội kép có thể sử dụng ngay để chọn lọc và đánh giá khả năng kết hợp do có mức độổn định di truyền rất cao nên có thể cốđịnh ưu thế lai ở ngay thế hệ S1. Trong khi các dòng tạo ra bằng phương pháp tự phối cần đạt đến sự ổn định cần thiết mới có thể khai thác và sử dụng (Smith J. S. C. et al., 2008). Ngoài ra, dòng đơn bội kép còn được sử dụng trong phân tích di truyền và xác định các chức năng của gen lặn, cũng như tạo ra các nguồn tế bào mô sẹo đơn bội và nhị bội kép dùng trong các nghiên cứu chuyển gen (Khush G. S. and Virlnani S. S., 1996).
Năm 2007, Pedro và cs đã khẳng định tầm quan trọng của việc tạo dòng đơn bội kép trong các chương trình phát triển ngô lai ở vùng nhiệt đới (Pedro R. B. et al., 2007). Hiện nay, hầu hết các công ty giống đều có chương trình nghiên cứu, sản xuất các dòng đơn bội kép để tạo giống ngô lai thương mại.
Phương pháp tạo dòng đơn bội kép từ nuôi cấy bao phấn cũng được khẳng định là một trong những hướng nghiên cứu hiệu quảở Việt Nam (Bùi Mạnh Cường, 2007). Kết quả của các nghiên cứu cho thấy: các dòng đơn bội kép tạo ra đáp ứng được tiêu chuẩn của dòng có thể tham gia vào chương trình chọn tạo giống ngô lai (Bùi Mạnh Cường và cs, 2002); Tỷ lệ các dòng đơn bội kép hữu dục trên đồng ruộng đạt 10 - 12% và có thể tham gia vào các tổ hợp lai triển vọng.