Đánh giá khả năng kết hợp thực chất là xác định tác động gen. Việc giữ lại hay loại bỏ dòng thuần dựa trên các kết quảđánh giá khả năng kết hợp (Hallauer A. R. and Miranda J. B., 1988). Khó khăn nhất trong việc đánh giá khả năng kết hợp của một dòng là tính không đo đếm được của nó. Ngoài ra, giữa các tính trạng đo đếm được của dòng không có sự tương quan hoặc tương quan rất thấp với khả năng kết hợp.
Cho đến nay, phương pháp chắc chắn nhất đểđánh giá khả năng kết hợp của các dòng thuần là lai thử và thử nghiệm các tổ hợp lai (Ngô Hữu Tình, 2009).
Sprague và Tatum (1942) đã chứng minh rằng, ảnh hưởng của khả năng kết hợp chung lớn hơn và quan trọng đối với nhưng dòng không được chọn lọc, ảnh hưởng của khả năng kết hợp riêng quan trọng hơn ở tổ hợp lai giữa các dòng mà đã
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
được thử trước. Những dòng không được thử trước, sự khác nhau về khả năng kết hợp chung lớn hơn sự khác nhau về khả năng kết hợp riêng (Sprague G. F. and Tatum L. A., 1942).
Quan hệ giữa khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng thông qua tác động trội và ức chế được xác định bằng việc tính toán các phương sai di truyền cộng, di truyền trội và ức chế trội (Darrah L. L. and Hallauer A. R., 1972).
Từ kết quả đánh giá khả năng kết hợp của các dòng tự phối, thông qua các tính trạng ở tổ hợp lai của chúng, từđó có quyết định về việc giữ lại những dòng có khả năng kết hợp cao, loại bỏ những dòng có khả năng kết hợp thấp không có tác dụng khi lai, cũng như sử dụng các dòng có khả năng kết hợp chung và riêng cao vào các mục đích tạo giống khác (Mai Xuân Triệu, 1998).
Phương pháp lai thử để đánh giá khả năng kết hợp của dòng thuần được nhiều nhà chọn tạo giống ngô áp dụng, trong nghiên cứu thường sử dụng hai hệ thống lai thử là lai đỉnh và lai luân giao.
* Giai đoạn thử và chọn cây thử
Giai đoạn lai thử phụ thuộc nhiều vào các nhà chọn giống: Lai thử muộn nếu nhà chọn giống cho rằng chọn lọc là hiệu quả đối với đặc tính mong muốn, lai thử sớm nếu muốn loại bỏ các dòng có khả năng kết hợp kém để tập trung chọn lọc ở các thế hệ sau đối với các dòng có khả năng kết hợp tốt hơn. Theo Bauman thì khoảng 60% các nhà chọn giống đánh giá dòng bằng phương pháp lai thử sớm ở thế hệ S3, S4, khoảng 22% lai thửở thế hệ tự phối S5 hoặc muộn hơn (Bauman L. F., 1981). Đối với dòng đơn bội kép có thể lai thửở thế hệđầu tiên.
Cây thử (tester) – theo như các nhà khoa học CIMMYT định nghĩa là một kiểu gen (giống thụ phấn tự do, giống tổng hợp, dòng thuần hay giống lai) giúp: dễ dàng phân biệt các dòng về giá trị di truyền và khả năng kết hợp, giảm được các giai đoạn thử trong quá trình chọn tạo giống lai và nhận biết các tổ hợp lai triển vọng (Vasal S. K. et al., 1995).
Chỉ tiêu chung được các nhà tạo giống chấp nhận đó là chọn cây thử không có quan hệ họ hàng với các vật liệu đem thử và tốt nhất là thuộc nhóm thế hệ lai đối
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
ứng. Để tăng mức độ tin cậy thường sử dụng hai hoặc nhiều cây thử có nền di truyền khác nhau (Ngô Hữu Tình và Nguyễn Đình Hiền, 1996).
Xuất phát từ thực tế, các nhà chọn tạo giống thương mại ưu tiên sử dụng dòng thuần ưu tú làm cây thử với mong muốn phát hiện nhanh một tổ hợp lai đỉnh sẽ là một giống lai đơn triển vọng.
* Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp lai đỉnh
Lai đỉnh (topcross) là phương pháp lai thử để xác định khả năng kết hợp chung do Davis đề xuất năm 1927, Jenkins và Bruce phát triển năm 1932 (Hallauer A. R. and Miranda J. B., 1988). Phương pháp lai đỉnh rất có ý nghĩa trong giai đoạn đầu của quá trình chọn lọc khi khối lượng vật liệu trong thí nghiệm còn quá lớn. Trong lai đỉnh tất cả các vật liệu cần xác định khả năng kết hợp được lai với một dạng chung gọi là cây thử (tester), quyết định sự thành công của lai đỉnh là chọn đúng cây thử.
* Lai đỉnh toàn phần
Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi dạng mẹ được lai với tất cả các cây thử. Phân tích thống kê khả năng kết hợp của lai đỉnh toàn phần tiến hành theo các bước: Xác định tác động của khả năng kết hợp chung của dòng, của cây thử; Tác động tương tác dòng x cây thử (tác động của khả năng kết hợp riêng) và xác định độ tin cậy qua sai số và LSD.
Trong các chương trình tạo giống, để chọn lọc các dòng ưu tú có khả năng tham gia vào tổ hợp lai cho ưu thế lai cao phục vụ sản xuất, các nhà chọn tạo giống ngô Việt Nam đã áp dụng phương pháp lai đỉnh trong nghiên cứu: Bùi Mạnh Cường chọn 2 cây thử LDB3, TSB1 cho nhóm chín muộn và 2 cây thử LDSB2, TSB2 cho nhóm chín sớm để đánh giá khả năng kết hợp của 50 dòng ngô (Bùi Mạnh Cường, 1994); Mai Xuân Triệu sử dụng các cây thử khác nhau để đánh giá khả năng kết hợp của 12 dòng dài ngày, 10 dòng trung ngày và 11 dòng ngắn ngày với các cặp cây thử tương ứng là IL25 và TSB1, P11 và Bighei, TSB2 và IL246 (Mai Xuân Triệu, 1998).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
* Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp lai luân giao
Luân giao là phương pháp đánh giá khả năng kết hợp do Sprague và Tatum đề xuất, được phát triển bởi nhiều nhà khoa học mà đặc biệt là Griffing (Griffing B., 1956). Qua phân tích luân giao sẽ thu được các thông tin về: bản chất và ước lượng các chỉ số di truyền; khả năng kết hợp chung và riêng của bố mẹ và các tổ hợp lai của chúng.
* Luân giao toàn phần
Là hệ thống lai thử trong đó các vật liệu được lai theo tất cả các tổ hợp có thể. Các dòng này vừa là cây thử của các dòng khác, vừa là cây thử của chính mình. Phân tích lai luân giao cho thông tin về: bản chất và giá trị thực của tham số di truyền, khả năng kết hợp chung và riêng của các bố mẹ biểu hiện ở các con lai. Có 2 phương pháp chính trong phân tích luân giao:
+ Phương pháp Hayman: có thể xác định được một số tham số di truyền của các nguồn vật liệu cũng nhưước đoán giá trị tổ hợp lai (Hayman B. I., 1954).
+ Phương pháp Griffing: giúp chúng ta xác định các thành phần phương sai khả năng kết hợp chung và riêng. Từđó có thểước lượng các thành phần biến động do khả năng kết hợp chung, khả năng kết hợp riêng được qui đổi sang thành biến động do hiệu quả cộng tính, hiểu quả trội và siêu trội của các gen (Griffing B., 1956).
Kết quảđánh giá khả năng kết hợp của dòng bằng phương pháp lai luân giao giúp các nhà nghiên cứu phân nhóm ưu thế lai và sử dụng chúng trong tạo giống, chọn ra những tổ hợp lai tốt phục vụ cho sản xuất.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
Phần 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu và hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Gồm 25 dòng ngô nếp tạo ra từ phương pháp nuôi cấy bao phấn thuộc tập đoàn dòng của Viện Nghiên cứu Ngô (bảng 3.1).
Bảng 3.1. Danh sách 25 dòng ngô nếp nghiên cứu TT Ký hiệu Tên dòng Nguồn gốc TT Ký hiệu Tên dòng Nguồn gốc 1 N1 C1144 SW236/SW303 14 N14 C1230 SW236/SW277 2 N2 C1147 SW236/SW303 15 N15 C1243 Wax48 3 N3 C1149 Nếp trắng Chư Sê/Wax44 16 N16 C1248 Wax44/Nếp Phú Lương 4 N4 C1152 Nếp trắng Chư Sê/Wax44 17 N17 C1258 Fancy white super 212 5 N5 C1154 Nếp F1 Ngọc Mỹ Trân 18 N18 C1263 Wax73 6 N6 C1155 Nếp F1 Ngọc Mỹ Trân 19 N19 C1279 Wax44 7 N7 C1160 Wax50 20 N20 C1323 Wax44 8 N8 C1167 Nếp F1 Ngọc Mỹ Trân 21 N21 C1567 MX10 9 N9 C1180 MX10 22 N22 C1572 Wax44 10 N10 C1187 MX10 23 N23 C1583 HN88 11 N11 C1191 MX10 24 N24 C1648 Wax44 12 N12 C1213 MX10 25 N25 C1656 HN88 13 N13 C1224 SW236/SW277
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
+ Giống dùng làm đối chứng trong khảo nghiệm là: MX10 và Wax44 hiện đang được sản xuất phổ biến ở các vùng trồng ngô trên cả nước.
+ 22 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi AMBIONET – CIMMYT (bảng 3.2) (Ambionet - Cimmyt, 2004).
Bảng 3.2. Danh sách 22 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu TT Tên mồi Trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngược (R)
Từ đầu 5’ đến 3’ Kiểu lặp lại
Kích thước các alen (bp) Số alen 1 phi339017 F - ACTGCTGTTGGGGTAGGG R - GCAGCTTGAGCAGGAAGC AGG 148-163 5 2 phi227562 F - TGATAAAGCTCAGCCACAAGG R - ATCTCGGCTACGGCCAGA ACC 307-328 7 3 phi083 F - CAAACATCAGCCAGAGACAAGGAC R - ATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT AGCT 125-137 5 4 phi374118 F - TACCCGGACATGGTTGAGC R - TGAAGGGTGTCCTTCCGAT ACC 217-238 6 5 Phi029 F - TTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAA R - ATTTCCAGTTGCCACCGACGAAGAACTT AG/AGC G*** 148-162 6 6 phi102228 F - ATTCCGACGCAATCAACA R - TTCATCTCCTCCAGGAGCCTT AAGC 123-131 3 7 phi053 F - CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC R - AACCCAACGTACTCCGGCAG ATAC 169-195 6 8 phi072 F - ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT R - GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT AAAC 143-167 6 9 phi213984 F - GTGACCTAAACTTGGCAGACCC R - CAAGAGGTACCTGCATGGC ACC 287-305 2 10 phi093 F - AGTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG R - AGGCCATGCATGCTTGCAACAATGGATACA AGCT 274-294 4 11 umc1109 F - GCAACACAGGACCAAATCATCTCT R - GTTCGGTCCGTAGAAGAACTCTCA (ACG)4 104-116 4 12 phi101049 F - CCGGGAACTTGTTCATCG R - CCACGTCCATGATCACACC AGAT 148-174 8 13 phi087 F - GAGAGGAGGTGTTGTTTGACACAC R - ACAACCGGACAAGTCAGCAGATTG ACC 150-177 4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 R - TGGGTTTTGTTTGTTTGTTTGTTG 15 phi423796 F - CACTACTCGATCTGAACCACCA R - CGCTCTGTGAATTTGCTAGCTC AGATG 121-141 6 16 umc1304 F - CATGCAGCTCTCCAAATTAAATCC R - GCCAACTAGAACTACTGCTGCTCC (TCGA)4 129-137 2 17 umc1279 F - GATGAGCTTGACGACGCCTG R - CAATCCAATCCGTTGCAGGTC (CCT)6 92-101 4 18 phi065 F - AGGGACAAATACGTGGAGACACAG R - CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC CACTT 131-151 4 19 phi108411 F - CGTCCCTTGGATTTCGAC R - CGTACGGGACCTGTCAACAA AGCT 125-129 3 20 phi063 F - GGCGGCGGTGCTGGTAG R - CAGCTAGCCGCTAGATATACGCT TATC 157-219 6 21 phi96342 F - GTAATCCCACGTCCTATCAGCC R - TCCAACTTGAACGAACTCCTC ATCC 234-250 5 22 umc1196 F - CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGA R -AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT CACACG 137-161 5
- Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
+ Hóa chất: Tris - HCl, EDTA, RNAse, Agarose, Acrylamide, Urea, Bis - Acrylamide, Primer, Taq DNA polymerase, dNTP, PCR buffer, Ethydium bromide, TEMED, Marker DNA được mua từ hãng Invitrogen (Mỹ), Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Ammonium acetate, Tris - Base, Boric acid, Acid acetic, NaCl, CTAB, SDS, AgNO3, được mua từ hãng Sigma (Mỹ), Nitơ lỏng mua tại Việt Nam. Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử.
+ Máy móc, thiết bị thí nghiệm: Máy PCR MJ Research PTC - 100 Thermal Cycler; máy quang phổ kế Ultrospec 3000 pro; máy chạy điện di gel agarose EPS 301 và polyacrylamide Sequi - Gen GT; máy ly tâm lạnh; máy lắc ổn nhiệt; máy khuấy từ, cân phân tích, máy đo pH, tủổn nhiệt, máy soi gel, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh và các trang thiết bị khác. Các thiết bịđược sử dụng thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Nghiên cứu Ngô.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Tại Viện Nghiên cứu Ngô - Đan Phượng - Hà Nội.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp theo dõi, đánh giá thí nghiệm ngoài đồng ruộng
Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm đánh giá dòng: các dòng được bố trí tuần tự, không nhắc lại, mỗi hàng dài 5m, khoảng cách gieo 70cm x 22 cm/hốc, 1 cây/hốc, mỗi dòng gieo 7 hàng.
- Thí nghiệm đánh giá các tổ hợp lai: các tổ hợp lai được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh 3 lần nhắc lại, mỗi công thức gieo 4 hàng, mỗi hàng dài 5m, khoảng cách gieo 70cm x 25 cm/hốc, 1 cây/hốc.
Chăm sóc thí nghiệm
+ Phân bón:
Liều lượng phân bón cho 1ha: 2500kg vi sinh + 140kgN + 80kgP2O5 + 60kgK2O
Bón lót toàn bộ phân vi sinh và phân lân trước khi gieo.
+ Các biện pháp chăm sóc được thực hiện theo hướng dẫn của Viện Nghiên cứu Ngô.
Các chỉ tiêu theo dõi: Được tiến hành theo hướng dẫn của CIMMYT (1985) và
Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về khảo nghiệm giống cây trồng của Bộ Nông nghiệp và Phát triên nông thôn (2011).
- Thời gian sinh trưởng: Theo dõi ngày tung phấn (khi có 50% số cây có hoa nở ở 1/3 trục chính), ngày phun râu (khi có 50% số cây có râu nhú dài 2 – 3cm), ngày chín (khi có 75% số bắp có điểm đen ở chân hạt).
- Các chỉ tiêu hình thái: Mỗi công thức đo đếm 10 cây.
+ Chiều cao cây (cm): Đo từ mặt đất đến đốt phân nhánh cờđầu tiên. + Chiều cao đóng bắp (cm): Đo từ mặt đất đến đốt mang bắp trên cùng. + Dài cờ (cm): Được đo từđốt có nhánh cờđầu tiên đến điểm mút của nhánh cờ. + Số nhánh cờ.
+ Độ che phủ lá bi: Được tính theo thang điểm từ 1 đến 5 khi quan sát các cây trong ô ở giai đoạn chín sáp.
Trong đó: 1 – rất kín (lá bi kín đầu bắp và vượt khỏi bắp) 2 – kín (lá bi bao kín đầu bắp)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
3 – hơi hở (lá bi bao không chặt đầu bắp) 4 – hở (lá bi không che kín bắp để hởđầu bắp) 5 – rất hở (bao bắp rất kém đầu bắp hở nhiều)
- Khả năng chống chịu sâu bệnh:
+ Sâu đục thân: Được tính theo thang điểm từ 1 đến 5 dựa vào tỷ lệ cây bị sâu trên tổng số cây trong ô thí nghiệm.
Trong đó: 1 - sạch bệnh đến nhiễm rất nhẹ (<5%), 2 - nhiễm nhẹ (5 – 15%), 3 - nhiễm vừa (15 – 25%), 4 - nhiễm nặng (25 – 35%), 5 - rất nặng (35-<50%).
+ Bệnh khô vằn (%): Được tính bằng tỷ lệ cây bị bệnh trên tổng số cây trong ô thí nghiệm.
+ Bệnh đốm lá: Được tính theo thang điểm từ 0 đến 5 dựa vào tỷ lệ diện tích lá bị bệnh.
Trong đó: 0 - sạch bệnh, 1- nhiễm rất nhẹ (1 - 10%), 2 - nhiễm nhẹ (11 – 25%), 3 - nhiễm vừa (26 – 50%), 4 - nhiễm nặng (51 - 75%), 5 - rất nặng (>75%).
+ Chống đổ: Được tính bằng tỉ lệ cây nghiêng 300 trở lên so với phương thẳng đứng trên tổng số cây trong ô thí nghiệm.
- Các yếu tố cấu thành năng suất: Mỗi công thức đo đếm 10 bắp. + Chiều dài bắp (cm): Đo ở phần bắp có hàng hạt dài nhất. + Đường kính bắp (cm): Đo ở phần giữa bắp.
+ Số hàng hạt/bắp: Hàng hạt được tính từ khi có 50% số hạt so với hàng dài nhất. + Số hạt/hàng: Đếm theo hàng hạt có chiều dài trung bình trên bắp.
+ Khối lượng 1000 hạt (g) (P1000 hạt) ở độ ẩm 14%: cân 2 mẫu, mỗi mẫu 500 hạt, độ chênh lệch giữa các mẫu < 5% là chấp nhận được.
+ Màu và dạng hạt: Xác định màu và dạng hạt lúc thu hoạch.
- Đánh giá năng suất:
+ Năng suất thực thu (NSTT):
NSTT (tạ/ha) = P.ô x tỷ lệ hạt tươi/bắp tươi x (100 - A
0)
x 100 S.ô x (100 - 14)
Trong đó: P.ô là khối lượng bắp tươi/ô (kg) A0 là độẩm hạt khi thu hoạch S.ô là diện tích ô thí nghiệm (m2)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 + Năng suất bắp tươi (NSBT): NSBT (tạ/ha) = P.ô x 100 S.ô
Trong đó: P.ô là khối lượng bắp tươi/ô (kg) S.ô là diện tích ô thí nghiệm (m2)
- Đánh giá chất lượng ăn tươi:
Đánh giá của hội đồng thử chất lượng (5 – 10 người) cho điểm theo 3 chỉ tiêu vềđộ dẻo, hương thơm và vị đậm, bắp tươi được thử ở giai đoạn sau khi phun râu 18 – 25 ngày. Đánh giá theo thang điểm 1 – 5 (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Chỉ tiêu chất lượng ăn tươi