Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm đánh giá dòng: các dòng được bố trí tuần tự, không nhắc lại, mỗi hàng dài 5m, khoảng cách gieo 70cm x 22 cm/hốc, 1 cây/hốc, mỗi dòng gieo 7 hàng.
- Thí nghiệm đánh giá các tổ hợp lai: các tổ hợp lai được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh 3 lần nhắc lại, mỗi công thức gieo 4 hàng, mỗi hàng dài 5m, khoảng cách gieo 70cm x 25 cm/hốc, 1 cây/hốc.
Chăm sóc thí nghiệm
+ Phân bón:
Liều lượng phân bón cho 1ha: 2500kg vi sinh + 140kgN + 80kgP2O5 + 60kgK2O
Bón lót toàn bộ phân vi sinh và phân lân trước khi gieo.
+ Các biện pháp chăm sóc được thực hiện theo hướng dẫn của Viện Nghiên cứu Ngô.
Các chỉ tiêu theo dõi: Được tiến hành theo hướng dẫn của CIMMYT (1985) và
Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về khảo nghiệm giống cây trồng của Bộ Nông nghiệp và Phát triên nông thôn (2011).
- Thời gian sinh trưởng: Theo dõi ngày tung phấn (khi có 50% số cây có hoa nở ở 1/3 trục chính), ngày phun râu (khi có 50% số cây có râu nhú dài 2 – 3cm), ngày chín (khi có 75% số bắp có điểm đen ở chân hạt).
- Các chỉ tiêu hình thái: Mỗi công thức đo đếm 10 cây.
+ Chiều cao cây (cm): Đo từ mặt đất đến đốt phân nhánh cờđầu tiên. + Chiều cao đóng bắp (cm): Đo từ mặt đất đến đốt mang bắp trên cùng. + Dài cờ (cm): Được đo từđốt có nhánh cờđầu tiên đến điểm mút của nhánh cờ. + Số nhánh cờ.
+ Độ che phủ lá bi: Được tính theo thang điểm từ 1 đến 5 khi quan sát các cây trong ô ở giai đoạn chín sáp.
Trong đó: 1 – rất kín (lá bi kín đầu bắp và vượt khỏi bắp) 2 – kín (lá bi bao kín đầu bắp)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
3 – hơi hở (lá bi bao không chặt đầu bắp) 4 – hở (lá bi không che kín bắp để hởđầu bắp) 5 – rất hở (bao bắp rất kém đầu bắp hở nhiều)
- Khả năng chống chịu sâu bệnh:
+ Sâu đục thân: Được tính theo thang điểm từ 1 đến 5 dựa vào tỷ lệ cây bị sâu trên tổng số cây trong ô thí nghiệm.
Trong đó: 1 - sạch bệnh đến nhiễm rất nhẹ (<5%), 2 - nhiễm nhẹ (5 – 15%), 3 - nhiễm vừa (15 – 25%), 4 - nhiễm nặng (25 – 35%), 5 - rất nặng (35-<50%).
+ Bệnh khô vằn (%): Được tính bằng tỷ lệ cây bị bệnh trên tổng số cây trong ô thí nghiệm.
+ Bệnh đốm lá: Được tính theo thang điểm từ 0 đến 5 dựa vào tỷ lệ diện tích lá bị bệnh.
Trong đó: 0 - sạch bệnh, 1- nhiễm rất nhẹ (1 - 10%), 2 - nhiễm nhẹ (11 – 25%), 3 - nhiễm vừa (26 – 50%), 4 - nhiễm nặng (51 - 75%), 5 - rất nặng (>75%).
+ Chống đổ: Được tính bằng tỉ lệ cây nghiêng 300 trở lên so với phương thẳng đứng trên tổng số cây trong ô thí nghiệm.
- Các yếu tố cấu thành năng suất: Mỗi công thức đo đếm 10 bắp. + Chiều dài bắp (cm): Đo ở phần bắp có hàng hạt dài nhất. + Đường kính bắp (cm): Đo ở phần giữa bắp.
+ Số hàng hạt/bắp: Hàng hạt được tính từ khi có 50% số hạt so với hàng dài nhất. + Số hạt/hàng: Đếm theo hàng hạt có chiều dài trung bình trên bắp.
+ Khối lượng 1000 hạt (g) (P1000 hạt) ở độ ẩm 14%: cân 2 mẫu, mỗi mẫu 500 hạt, độ chênh lệch giữa các mẫu < 5% là chấp nhận được.
+ Màu và dạng hạt: Xác định màu và dạng hạt lúc thu hoạch.
- Đánh giá năng suất:
+ Năng suất thực thu (NSTT):
NSTT (tạ/ha) = P.ô x tỷ lệ hạt tươi/bắp tươi x (100 - A
0)
x 100 S.ô x (100 - 14)
Trong đó: P.ô là khối lượng bắp tươi/ô (kg) A0 là độẩm hạt khi thu hoạch S.ô là diện tích ô thí nghiệm (m2)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 + Năng suất bắp tươi (NSBT): NSBT (tạ/ha) = P.ô x 100 S.ô
Trong đó: P.ô là khối lượng bắp tươi/ô (kg) S.ô là diện tích ô thí nghiệm (m2)
- Đánh giá chất lượng ăn tươi:
Đánh giá của hội đồng thử chất lượng (5 – 10 người) cho điểm theo 3 chỉ tiêu vềđộ dẻo, hương thơm và vị đậm, bắp tươi được thử ở giai đoạn sau khi phun râu 18 – 25 ngày. Đánh giá theo thang điểm 1 – 5 (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Chỉ tiêu chất lượng ăn tươi
Chỉ tiêu Điểm 1 2 3 4 5 Độ dẻo Rất dẻo Dẻo Dẻo vừa Ít dẻo Không dẻo Hương thơm Rất thơm Thơm Thơm vừa Ít thơm Không thơm Vịđậm Rất đậm Đậm Đậm vừa Ít đậm Không đậm 3.3.2. Đánh giá ưu thế lai và khả năng kết hợp
- Ưu thế lai chuẩn (Hs): Giá trị một tính trạng nào đó của con lai (F1) so với giá trị giống thương mại đại trà (S).
Hs (%) = F1 – S x 100
S
Khả năng kết hợp về năng suất của các dòng được xác định qua lai luân giao theo “Các phương pháp thử và phân tích khả năng kết hợp trong các thí nghiệm về ưu thế lai” (Ngô Hữu Tình và Nguyễn Đình Hiền, 1996).
3.3.3. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR
Tách chiết ADN tổng số
Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, mỗi cây lấy 1 lá ở giai đoạn 3 tuần tuổi. Quy trình tách chiết ADN tổng số theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) (Saghai Maroof M. A. et al., 1984).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
- Nghiền mẫu lá tươi trong Nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml, sau đó bổ sung 2 - 3ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 650C), đảo đều mẫu nhẹ nhàng.
- Ủ mẫu ở 650C trong thời gian 45 - 60 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chiết ADN 2 lần với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly tâm mỗi lần ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống eppendorf sang một ống mới.
- Kết tủa ADN với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate, đảo đều ở - 200C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Rửa ADN trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút.
- Làm khô AND, hòa tan ADN trong 100µl dung dịch TE bảo quản ở - 200C.
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch ADN tổng số
Độ tinh sạch và nồng độ của ADN tổng sốđược đo bằng máy đo quang phổ (Ultrospec UV/Visible - 65 spectrophotometer). Nồng độ ADN được tính theo công thức sau:
Nồng độ ADN (µg/ml) = (OD260 x 50 x 50µg/ml)/1000 Trong đó: OD260 là chỉ sốđo được ở bước sóng λ = 260.
50 là hệ số pha loãng. 50µg/ml là hằng số.
Tỷ lệ OD260/OD280 phản ánh độ tinh sạch của mẫu (thường trong khoảng 1,8 - 2,0).
Phản ứng PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction, chạy điện di và nhuộm
mẫu)
- Thành phần của một phản ứng PCR
Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể được thể hiện ở bảng 3.4.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Bảng 3.4. Thành phần của một phản ứng PCR TT Dung dịch gốc Nồng độ sử dụng Thể tích (µl) 1 Nước cất vô trùng - 5,6 2 Đệm PCR 10X 1X 1,0 3 MgCl2 25mM 2,0 mM 0,8 4 4 loại dNTP 0,25mM 1,0
5 Taq DNA polymerase 5U/ul 0,5U 0,1
6 Mồi xuôi 5µM 0,25µM 0,25
7 Mồi ngược 5µM 0,25µM 0,25
8 ADN khuôn 10ηg/µl 10ηg 1,0
Tổng thể tích của một phản ứng 10,0
- Chương trình chạy PCR
Phản ứng PCR được tiến hành trong plate 96 giếng và chạy theo chương trình cụ thểở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Phản ứng Chu trình nhiệt
1 Biến tính đầu tiên 940C trong 2 phút
2 Biến tính 940C trong 30 giây
3 Gắn mồi 560C trong 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 720C trong 1 phút
5 Lặp lại từ bước 2, 29 lần
6 Kéo dài chuỗi cuối cùng 720C trong 5 phút
7 Bảo quản 40C, ∞
Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4µl dung dịch SSS (Sequencing Stop Solution - Bao gồm: 10mM NaOH + 95% formamide + 0,05% bromophenol + 0,05% xylene cyanol).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Các sản phẩm PCR và marker ADN có khối lượng chuẩn (ФX174 ADN/HinfI, 20ηg/µl) được biến tính ở 950C trong 5 phút, sau đó ngay lập tức làm lạnh và giữ trong đá cho đến khi được tra vào bản gel.
Sản phẩm PCR sau khi biến tính và sốc nhiệt trong đá lạnh được đưa vào chạy điện di trên gel polyacrylamide 4,5% ở nhiệt độ 500C.
Gel polyacrylamide bao gồm 60ml polyacrylamide 4,5%, bổ sung thêm 600µl dung dịch APS 10% và 60µl dung dịch TEMED.
Bảng 3.6. Thành phần gel polyacrylamide 4,5% TT Dung dịch gốc Thể tích 1 Acrylamide 40% 6,75ml 2 Ure 25,2g 3 TBE 5X 12ml Tổng thể tích 60ml
- Phương pháp nhuộm bạc đối với gel polyacrylamide
+ Sau khi kết thúc thời gian điện di, cố định tấm kính bám gel bằng dung dịch cốđịnh gel (Glacial acetic acid 10%) trong 20 phút;
+ Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cốđịnh, rửa bằng nước cất hai lần trong 5 phút; + Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút (chuẩn bị dung dịch nhuộm trước bằng cách: hòa tan 1g AgNO3 trong 1 lít nước cất hai lần khử ion, sau đó bổ sung 1,5ml dung dịch formaldehyde 37%);
+ Bản gel được rửa lại bằng nước cất hai lần trong thời gian 5 - 10 giây; + Đưa bản gel vào dung dịch hiện (chuẩn bị trước: hòa tan 30g Na2CO3 trong 1 lít nước cất hai lần khử ion, làm lạnh ở nhiệt độ - 200C. Trước khi dung bổ sung 1,5ml formaldehyde 37% + 200ml sodium thiosulfate 10mg/ml), lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất hiện, sau đó đổ trực tiếp dung dịch cố định (đã dùng ở trên) lên trên bản gel để dừng phản ứng hiện, duy trì trong 4 - 6 phút;
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Phương pháp xử lý số liệu đồng ruộng
- Các số liệu được thu thập và xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên chương trình Excel version 5.0, MSTATC.
- Phân tích khả năng kết hợp bằng chương trình Di truyền số lượng của Ngô Hữu Tình và Nguyễn Đình Hiền (1996).
Phương pháp xử lý số liệu trong phòng thí nghiệm
Số liệu được thống kê và xử lý theo hướng dẫn của AMBIONET - CIMMYT (2004) (Ambionet - Cimmyt, 2004). Dựa vào thang chuẩn phiX174/HinfI, số liệu được đọc theo quy ước: các alen xuất hiện băng ADN (1), không xuất hiện băng (0) và khuyết số liệu (9). Kết quảđược phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2.1.
• Hệ số PIC (Polymorphic Information Content - Chỉ số thông tin đa hình).
PIC = 1- ∑P2i ; Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i • Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) được tính cho từng dòng và từng mồi.
M% dòng = dông sö måi sè Tæng liÖu sè khuyÕt måi Sè x 100 M% mồi = cøu n nghiª dßng sè Tæng liÖu sè khuyÕt dßng Sè x 100 • Khoảng cách di truyền (GD). GD = 1 - GS Trong đó: GD là khoảng cách di truyền
GS là độ tương đồng di truyền được tính theo hệ số Jaccard (Lanza L. L. B. et al., 1997).
• Phân nhóm bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair - Group Method with Arithmetical Averages).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quảđánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô nghiên cứu
Trong phạm vi thí nghiệm, đề tài đã đánh giá được một sốđặc điểm về thời gian sinh trưởng, đặc điểm hình thái (chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, dài cờ, số nhánh cờ, độ che phủ lá bi), khả năng chống chịu, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của 25 dòng ngô nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1, 4.2, 4.3, 4.4.
4.1.1. Thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu
Đánh giá thời gian sinh trưởng của các dòng ngô có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, giúp các nhà chọn giống có thể định hướng sử dụng dòng thuần trong công tác chọn tạo giống lai thích hợp hơn.
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, các dòng ngô nghiên cứu có thời gian sinh trưởng dao động từ 103 – 112 ngày, phần lớn các dòng thuộc nhóm chín trung bình sớm. Thời gian từ khi gieo đến khi chín sinh lý trung bình là 106 ngày. Dòng N10, N15 có thời gian sinh trưởng ngắn nhất là 103 ngày. Trong khi đó, dòng N22 lại có thời gian sinh trưởng dài nhất tương ứng 112 ngày.
Thời gian từ gieo đến tung phấn dao động từ 58 - 65 ngày. Thời gian từ khi gieo đến phun râu dao động từ 58 - 66 ngày.
Như vậy, nhìn vào bảng kết quả số liệu có thể thấy thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô không có sự chênh lệch lớn. Nhìn chung, thời gian tung phấn, phun râu của các dòng tương đối trùng khớp, mức độ chênh lệch tưng phấn – phun râu trong phạm vi cho phép ≤ 4 ngày.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu (Thu 2012)
TT Tên dòng Từ gieo đến các giai đoạn (ngày)
Tung phấn Phun râu Chín sinh lý
1 N1 59 60 105 2 N2 61 62 105 3 N3 59 60 105 4 N4 62 62 105 5 N5 59 60 105 6 N6 62 64 105 7 N7 65 66 110 8 N8 63 64 109 9 N9 58 60 106 10 N10 60 60 103 11 N11 64 65 108 12 N12 64 66 109 13 N13 61 62 109 14 N14 62 63 106 15 N15 58 58 103 16 N16 60 60 106 17 N17 61 62 105 18 N18 59 60 104 19 N19 61 61 106 20 N20 59 63 109 21 N21 62 62 108 22 N22 62 65 112 23 N23 63 64 110 24 N24 63 64 107 25 N25 61 62 105 Trung bình 62 62 106
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
4.1.2. Đặc điểm hình thái của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu
Các đặc điểm về hình thái là một yếu tố quan trọng cần phải lưu ý khi đánh giá dòng. Quan sát các đặc điểm hình thái (bảng 4.2) có thể đưa ra được nhận xét khá chính xác về khả năng sinh trưởng và phát triển, khả năng chống chịu của từng dòng.
Bảng 4.2. Đánh giá đặc điểm hình thái của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu (Thu 2012)
TT Tên dòng
Cao cây Đóng bắp Dài cờ Số nhánh cờ Độ che phủ lá bi (điểm) cm CV% cm CV% cm CV% nhánh CV% 1 N1 121,4 3,9 53,0 7,8 27,2 8,4 8,2 13,4 1 2 N2 137,6 4,1 66,6 6,3 32,6 7,7 12,2 13,5 1 3 N3 126,0 12,4 66,2 17,2 27,0 18,1 12,4 12,2 1 4 N4 144,4 4,1 76,0 11,8 30,8 12,9 16,2 13,4 1,5 5 N5 106,6 8,9 52,4 8,3 29,8 11,3 4,0 17,7 2 6 N6 136,0 3,6 59,6 6,1 31,4 8,0 9,8 11,2 2 7 N7 133,6 4,6 67,0 7,0 32,8 8,5 13,0 12,2 1,5 8 N8 131,2 2,9 68,0 8,4 30,8 9,0 10,8 7,7 1,5 9 N9 121,0 1,8 56,2 9,7 38,2 6,5 11,0 10,3 2 10 N10 126,4 3,7 52,6 9,3 29,0 10,1 10,2 8,2 2 11 N11 119,8 3,0 51,2 3,8 29,6 10,8 11,4 8,2 1 12 N12 137,6 4,1 54,4 8,1 32,0 6,6 7,4 8,0 1 13 N13 138,0 4,1 53,0 10,8 32,4 11,5 2,0 15,4 2,5 14 N14 160,8 6,5 88,0 8,6 34,6 6,3 10,0 10,0 1,5 15 N15 134,0 3,7 75,8 5,0 34,6 9,3 14,2 5,9 1 16 N16 113,0 8,0 47,0 9,5 26,8 8,9 7,0 10,3 1 17 N17 90,4 1,0 37,0 22,6 23,8 9,1 8,2 14,8 1 18 N18 124,2 1,4 53,2 14,4 28,6 10,1 9,6 13,3 1,5 19 N19 141,2 4,5 75,2 7,6 26,6 8,9 10,6 10,8 1,5 20 N20 130,4 13,7 66,0 15,5 21,8 9,9 6,2 11,0 1,5 21 N21 118,6 2,3 55,1 14,9 26,3 9,4 9,5 13,0 2 22 N22 132,0 10,9 56,6 12,5 33,2 7,5 11,4 10,2 2 23 N23 130,0 10,9 61,0 16,2 25,2 1,8 16,2 18,2 1,5 24 N24 123,2 3,5 51,8 4,6 30,6 5,9 10,6 14,3 2,5 25 N25 139,0 2,7 67,6 7,2 32,2 8,6 12,2 13,5 2,5