Mục đích: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men ethanol mạnh.
Phương pháp tiến hành
Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108 tế bào/mL.
Chuẩn bị dịch rỉ đường 22Brix, thanh trùng rỉ đường bằng NaHSO3 (liều lượng 146 mg/L) trong 2 giờ. Xác định độ pH của dung dịch rỉ đường.
Cho 99 mL dung dịch rỉ đường nồng độ 22ºBrix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.
Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã được nuôi cấy vào các bình tam giác, mật số nấm men khi chủng là 106
tế bào/mL.
Ủ 4-7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở các nhiệt độ 30ºC, 35ºC, 37ºC, 39ºC và 42oC.
. Đếm bọt khí sinh ra trong 2 phút sau 24 giờ.
Đo độ Brix và pH. Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC.
Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol: nồng độ ethanol thu được sau lên men ở nhiệt độ cao.
Tuyển chọn các chủng nấm men cho nồng độ ethanol cao ở nhiệt độ cao.
3.2.7. Phƣơng pháp phân tích thống kê
Số liệu sẽ được phân tích bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV, USA.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢI LUẬN
4.1. Phân lập nấm men
Phân lập được 20 chủng nấm men từ 6 mẫu men bánh mì (Ins, Mau, CT, TM, ML, MN) từ 3 địa điểm khác nhau trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Các chủng nấm men được phân lập từ những dạng men thương mại được bán thị trường (men khô, men tươi, men ngọt và men lạt). Tên các chủng phân lập và địa điểm thu mẫu được trình bày trong Bảng 4.
Bảng 4.Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu và tên các chủng phân lập
STT Tên
chủng
Tên mẫu Địa điểm thu mẫu
1 Ins 1 Men khô Ins Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 2 Ins 2 Men khô Ins Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 3 Ins 3 Men khô Ins Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 4 Mau 1 Men khô Mau Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 5 Mau 2 Men khô Mau Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 6 Mau 3 Men khô Mau Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 7 CT1 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ
8 CT2 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 9 CT3 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 10 CT4 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 11 TM1 Men tươi Mau Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 12 TM2 Men tươi Mau Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 13 TM3 Men tươi Mau Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 14 ML1 Men lạt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 15 ML2 Men lạt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 16 ML3 Men lạt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 17 MN1 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 18 MN2 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 19 MN3 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 20 MN4 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ
4.2. Xác định hình thái sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men
Theo Nguyễn Đức Lượng et al. (2003), có thể định danh sơ bộ các chủng nấm men dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men. Đặc điểm hình thái bao gồm mô tả hình thái tế bào nấm men khi nuôi cấy trên môi trường YPD
agar 2 ngày. Đặc điểm sinh lý bao gồm khả năng lên men đường, khả năng đồng hóa urea và khả năng phân giải gelatine.
4.2.1. Đặc điểm hình thái
Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc được ghi nhận từ các khuẩn lạc được cấy trên môi trường YPD sau 48 giờ ủ ở 30ºC. Nhìn chung, các chủng nấm men có sự khác biệt tương đối về đặc điểm bề mặt, dạng bìa, kích thước và màu sắc. Quan sát chó thấy 11 chủng nấm men có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục; 6 chủng nấm men có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục, bóng; 2 chủng nấm men có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng sữa và 1 chủng nấm men dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục, ngà. Về độ nổi khuẩn lạc, có 14 chủng nấm men với bề mặt khuẩn lạc trơn láng và 6 chủng nấm men với bề mặt khuẩn lạc sần. Dạng bìa cũng khá đa dạng, có 10 chủng nấm men dạng bìa nguyên, 4 chủng nấm men dạng bìa sợi, 3 chủng nấm men dạng bìa răng cưa, 2 chủng nấm men dạng bìa nguyên tỏa tia và 1 chủng nấm men có dạng bìa chia thùy.
Hình dạng của một số khuẩn lạc điển hình của các chủng nấm men được thể hiện ở Hình 7.
Hình 7. Hình dạng khuẩn lạc của một số chủng nấm men
Đặc tính hình thái tế bào của 20 chủng nấm men được kiểm tra dưới kình hiển vi (vật kính X100) cho thấy hình dạng chủ yếu của các tế bào nấm men bao gồm: hình cầu lớn, oval lớn, oval nhỏ, hình trụ, hình elip, elip dài và oval lớn dạng chùm. Các
TM2 CT4 Mau 3 ML1
đặc điểm hình thái và kích thước của khuẩn lạc và hình dạng tế bào nấm men được thể hiện trong Bảng 5.
Bảng 5. Đặc điểm hình thái và kích thƣớc của khuẩn lạc và hình dạng tế bào nấm men
STT Tên chủng
Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào
Đƣờng kính
(mm) Hình dạng, bề mặt và dạng bìa Màu sắc Hình dạng
1 Ins 1 2,5-3,5 Hình tròn, sần, bìa sợi Trắng đục Elip dài 2 Ins 2 3,5-4,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Hình trụ 3 Ins 3 1,5-2,5 Hình tròn, trơn,
bìa nguyên
Trắng sữa Cầu lớn
4 Mau 1 1,5-2,5 Hình tròn, sần, bìa sợi Trắng đục Oval lớn 5 Mau 2 2,5-3.5 Hình tròn, sần, bìa răng cưa Trắng đục Oval lớn 6 Mau 3 2,0-3,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục, bóng Oval nhỏ
7 CT1 3,5-4,5 Hình tròn, sần,
bìa chia thùy
Trắng đục Hình trụ 8 CT2 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Oval lớn 9 CT3 2,0-3,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Elip dài 10 CT4 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục, bóng Oval nhỏ 11 TM1 2,5-3,0 Hình tròn, trơn, bìa sợi Trắng đục Oval lớn 12 TM2 3,5-4,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Cầu lớn
13 TM3 1,5-2,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục, bóng Elip 14 ML1 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên, tỏa tia Trắng đục, bóng Elip 15 ML2 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa răng cưa Trắng đục Elip 16 ML3 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Oval lớn dạng
chùm 17 MN1 2,0-3,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên, tỏa
tia
Trắng đục, bóng Cầu lớn
18 MN2 1,0-2,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục,bóng Elip dài
19 MN3 3,5-4.5 Hình tròn, sần,
bìa răng cưa
Trắng đục, ngà Oval lớn
20 MN4 1,0-2,0 Hình tròn, sần, bìa sợi Trắng sữa Elip dài
Hình dạng tế bào của 20 chủng nấm men cũng khá đa dạng, có 5 chủng nấm men với hình dạng oval lớn, 4 chủng nấm men hình dạng elip dài, 3 chủng nấm men
dạng hình elip, 3 chủng nấm men có dạng hình cầu lớn, 2 chủng nấm men dạng hình oval nhỏ, 2 chủng nấm men có dạng hình trụ và 1 chủng nấm men có hình tế bào oval lớn dạng chùm.
Một số hình dạng chủ yếu của các nhóm tế bào được thể hiện ở Hình 8.
Hình 8. Hình dạng điển hình của 7 nhóm nấm menở vật kính X100
Ghi chú: A: Oval lớn (TM1), B: Oval nhỏ (Mau 3), C: Elip dài (MN4), D: Hình trụ (Ins 1),
E: Oval lớn dạng chùm (ML3), F: Cầu lớn (Ins 3), G: Hình elip (TM3)
Dựa vào đặc điểm hình thái của các tế bào nấm men, có thể chia 20 chủng nấm men thành 7 nhóm chính được tổng hợp trong Bảng 6.
Bảng 6. Tổng hợp các dạng tế bào của 20 nấm men phân bố ở 3 địa điểm
Địa điểm và số lƣợng mẫu phân lập
Hình dạng nấm men
Cầu Oval Oval Elip Elip Nấm men Hình trụ lớn lớn nhỏ dài dạng chùm Phòng Thực phẩm Huyện Vĩnh Thạnh Co.op mart + + + - + - + + + + + - - + + + - + + + -
*Ghi chú:(+) có xuất hiện khuẩn lạc; (-) không xuất hiện khuẩn lạc
A B C
D E
Ở mỗi địa điểm khác nhau thì có sự phân bố hình dạng tế bào khác nhau, nhưng nhìn chung đa số hình dạng cầu lớn, oval lớn và elip dài thì xuất hiện ở cả 3 địa điểm, điều này cho thấy hình dạng này phổ biến, đặc trưng cho các chủng nấm men.
4.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
Sau khi phân lập được những chủng nấm men đã ròng, tiến hành kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh sơ bộ các chủng nấm men.
Khả năng lên men đƣờng saccharose
Tất cả các chủng nấm men phân lập được thử khả năng lên men đường saccharose trong dung dịch 2% đường saccharose ở 30ºC trong 48 giờ. Kết quả được thể hiện trong Bảng 7 và Phụ lục 3.
Bảng 7. Chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham (mm) khi lên men đƣờng saccharose 2%
STT Chủng nấm men Chiều cao cột khí trong ống Durham (mm)
12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
1 ML1 30a 30a 30a 30a 2 ML2 0b 0c 0d 0e 3 ML3 0 0 0 0 4 Ins 1 0 0 0 0 5 Ins 2 0 0 0 0 6 Ins 3 30a 30 30 30 7 Mau 1 0 0 0 0 8 Mau 2 0 0 0 0 9 Mau 3 0,333b 5b 10c 13,333c 10 TM1 30a 30 30 30 11 TM2 0 0 0 0 12 TM3 0 6,333b 16,667b 19,667b 13 MN1 30a 30 30 30 14 MN2 0 6b 15,667b 19,667b 15 MN3 0 0 0 0 16 MN4 0 0 0 0 17 CT1 0 1c 3d 6d 18 CT2 30a 30a 30 30 19 CT3 0 0 0 0 20 CT4 0 0,333c 1,333d 3de
Ghi chú:Chiều cao tối đa của cột khí trong ống Durham là 30 mm. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
Kết quả cho thấy 8/20 chủng nấm men có khả năng sử dụng đường saccharose như nguồn cơ chất cho quá trình lên men. Đường saccharose rất phổ biến trong tự nhiên, là loại đường dễ hòa tan và có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng do cấu tạo từ 2 đơn phân là glucose và fructose.Có 3 chủng lên men rất mạnh, chiều cao cột khí đạt tối đa 30 mm sau 8 giờ (Ins3, TM1, CT2). Sau 12 giờ, 2 chủng ML1 và MN1 cũng đạt chiều cao cột khí 30 mm. Riêng các chủng Mau 3, TM3, MN2 không lên men trong giai đoạn đầu (sau 14 giờ), từ 16 giờ mới có dấu hiệu lên men (xuất hiện bọt khí) nhưng lên men rất yếu, chiều cao trung bình chỉ đạt 5-6,3 mm sau 48 giờ. Như vậy, các chủng nấm men có khả năng lên men đường saccharose khác nhau, thể hiện ở tốc độ và thời điểm bắt đầu lên men khác nhau.
Khả năng lên men đƣờng maltose
Tất cả các chủng nấm men phân lập được thử khả năng lên men đường maltose trong dung dịch 2% đường maltose ở 30ºC trong 24 giờ. Kết quả được thể hiện trong Bảng 8 và Phụ lục 3
Bảng 8. Chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham (mm) khi lên men đƣờng maltose 2%
STT Chủng nấm men Chiều cao cột khí trong ống Durham (mm)
12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
1 ML1 27a 30 30 30 2 ML2 4cd 30 30 30 3 ML3 0 0 0 0 4 Ins 1 4,333c 27,667a 30 30 5 Ins 2 0 0 0 0 6 Ins 3 30a 30 30 30 7 Mau 1 0 0 0 1,667d 8 Mau 2 2,667cd 27,667a 30 30 9 Mau 3 0 5,667b 16b 21,333bc 10 TM1 30 30 30 30 11 TM2 0 0 0 6,667d 12 TM3 0 1,667c 10c 15c 13 MN1 30 30 30 30 14 MN2 0 7b 26,333a 28ab 15 MN3 0 0 0 0 16 MN4 3,667cd 30 30 30 17 CT1 0 0 0 1,667d
18 CT2 30 30 30 30
19 CT3 1,833de 30 30 30
20 CT4 0 0,333c 1d 3d
Ghi chú:Chiều cao tối đa của cột khí trong ống Durham là 30 mm. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
Kết quả số liệu cho thấy có 13 chủng nấm men trong tổng số 20 chủng có khả năng lên men đường maltose. Trong đó, có 3 chủng lên men rất mạnh, chiều cao cột khí đạt được tối đa 30 mm sau 8 giờ (Ins 3, TM1 và CT2). Theo sau là 2 chủng ML1, MN1 cũng đạt được chiều cao cột khí 30 mm sau 14 giờ. Riêng chủng ML2 không lên men trong giai đoạn đầu (4 giờ), từ giờ thứ 8 mới có dấu hiệu lên lên men (xuất hiện bọt khí) và chỉ sau 20 giờ, chiều cao cột khí đạt cực đại 30 mm, còn 4 chủng nấm men (Ins1, Mau 2, MN4 và CT3) sau 24 giờ thì giá trị trung bình của chiều cao cột khí đạt 27,6-30 mm. Hơn nữa, có 3 chủng (Mau 3, TM3 và MN2) lên men rất yếu sau 24 giờ, chiều cao cột khí chưa đạt được tối đa. Như vậy, các chủng nấm men có khả năng lên men đường maltose khác nhau, phụ thuộc vào tốc độ và thời điểm bắt đầu lên men khác nhau.
Tóm lại, qua 2 thí nghiệm trên các chủng nấm men có khả năng sử dụng đường maltose đa dạng hơn so với đường saccharose, vì đường saccharose có cấu tạo từ 2 đơn phân là glucose và fructose, còn đường maltose, tuy là loại đường có độ ngọt kém hơn saccharose nhưng chúng dễ bị thủy phân bởi enzyme glucosidase tạo ra 2 phân tử đường glucose và nấm men thường lên men glucose (đây là loại đường đơn, một nguồn năng lượng dễ chuyển hóa) chính vì vậy đường maltose được nấm men sử dụng nhiều hơn đường saccharose.
Khả năng lên men các loại đường của nấm men là một đặc tính quan trọng. Trong quá trình sản xuất ethanol, chỉ một lượng đường nhất định trong cơ chất được chuyển thành ethanol, nên năng suất ethanol thu được sau lên men không cao mặc dù hàm lượng đường trong cơ chất ban đầu là đáng kể (Wu et al., 2010). Điều này xảy ra là do nấm men thường lên men glucose để tạo ethanol hơn là những loại đường khác và chúng chỉ chuyển hóa các loại đường khác trong trường hợp lượng glucose trong môi trường đã cạn kiệt (Tronchoni et al., 2009; Berthels et al., 2004; Berthels et al., 2008; Guillaume et al., 2007). Bên cạnh đó, khả năng lên men các loại đường của từng giống nấm men cũng rất khác nhau, điều này được đánh giá thông qua khả năng sinh ra CO trong quá trình lên men của nấm men. Ví dụ, giống Kluyveromyces,
Saccharomyces và Zygosaccharomyces có khả năng lên men tốt glucose và một số loại
đường khác, trong khi đó một số giống khác thì lên men rất yếu (Kurtman et al., 2011) Việc kiểm tra khả năng sử dụng các loại đường của nấm men sẽ là một trong những tiêu chí phân loại nấm men, đồng thời là bước đầu chọn lọc ra những chủng nấm men phù hợp cho lên men các loại cơ chất khác nhau nhằm tận dụng triệt để hơn nguồn đường trong cơ chất, bởi thành phần và tỷ lệ các loại đường trong từng loại cơ chất là rất khác biệt.
Khả năng phân giải Urea
Thí nghiệm thử khả năng phân giải urea, cho thấy có 8 chủng có kết quả dương tính (Bảng 9), làm đổi màu môi trường sang đỏ sẫm (Hình 9 và Phụ lục 1). Trong môi trường có chứa chất chỉ thị màu phenol red nên môi trường có màu vàng cam. Khi nấm men có enzyme sẽ phân giải urea tạo thành CO2 và NH3, chình NH3 làm tăng pH môi trường, phenol red chuyển sang màu đỏ. Như vậy, 8 chủng nấm men này có chứa enzyme urease có khả năng phân giải urea.
Hình 9. Sự đổi màu môi trƣờng có urea của một số chủng nấm men
Hagler và Ahearn (1981) đã nghiên cứu khả năng phân giải urea của một số loài nấm men và đưa ra kết luận rằng, đa số các loài thuộc giống nấm men sinh nang bào tử thường ít có khả năng phân giải urea, còn các loài thuộc giống sinh bào tử như