3.2.1. Phân lập các chủng nấm men từ nấm men thƣơng mại a) Thu mẫu
Thu thập mẫu từ các địa điểm: 2 mẫu của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm (men khô Mau và men khô Ins), 2 mẫu thu tại Huyện Vĩnh Thạnh (men tươi CT và men tươi Mau) và 2 mẫu thu ở siêu thị Co.op mart Cần Thơ (men lạt và men ngọt) .
b) Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy nấm men
Môi trường được pha đúng theo các thành phần trong công thức môi trường phân lập nấm men. Sau đó tiến hành khử trùng môi trường và đĩa petri bằng phương pháp nhiệt ướt ở 121ºC trong 20 phút. Kết thúc thời gian khử trùng, áp dụng thủ thuật vô trùng để rót môi trường vào đĩa petri (20 mL/đĩa) và để nguội.
c) Nuôi tăng sinh
Các mẫu nấm men khác nhau cho vào các bình tam giác chứa môi trường tăng sinh khối (lỏng) nấm men. Sau đó đem ủ lắc ở nhiệt độ phòng (28-30ºC) trong khoảng 48 giờ.
d)Phân lập nấm men
Sau khi nuôi tăng sinh, tiến hành phân lập nấm men theo các bước sau:
- Dùng micropipet hút mỗi mẫu 1 mL cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước cất vô trùng. Lần lượt pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 101
, 102, 103 và 104 trong các ống nghiệm chứa nước cất vô trùng.
- Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm bằng máy vortex và hút 10 µL ở mỗi độ pha loãng của mỗi mẫu nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy nấm men.
- Dùng que trải trãi đều dung dịch trên đĩa bằng thủ thuật vô trùng.
- Ủ các đĩa petri sau khi phân lập trong tủ ủ ở nhiệt độ tự nhiên (28-30ºC) trong 48 giờ.
- Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men trên môi trường thạch.
- Bảo quản trong tủ lạnh ở 4ºC.
Có nhiều cách kiểm tra:
- Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc: màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu.
- Quan sát nấm men dưới kính hiển vi: làm tiêu bản từ dịch lên men, nhuộm đơn bằng xanhmethylen rồi quan sát với vật kính X100 (vật kính dùng dầu).
3.2.2. Xác định hình thái sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men a. Đặc điểm hình thái a. Đặc điểm hình thái
- Mục đích: Xác định các đặc tính về hình dạng và kích thước của khuẩn lạc và tế bào nấm men đã phân lập được. Kiểu nẩy chồi và hình thành bào tử của tế bào nấm men.
- Phƣơng pháp tiến hành:
Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (yeast extract, peptone, D-glucose, tetracyline, agar).
Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ.
Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.
Làm tiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình dạng của tế bào và sử dụng trắc vi thị kính để đo kích thước tế bào nấm men.
b. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
* Kiểm tra khả năng lên men đường saccharose và maltose
+ Lấy 1 mL dung dịch nấm men đã được ủ sau 24 giờ cho vào chai Durham có chứa dung dịch saccharose 2% đã được khử trùng. Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham, ủ ở 30ºC.
+ Chỉ tiêu đánh giá: quan sát chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược sau 12, 24, 36 và 48 giờ ủ.
Thực hiện các bước tương tự đối với dung dịch đường maltose.
* Xác định hoạt tính phân giải urea
- Mục đích: Phát hiện nấm men có mang enzyme urease.
- Phương pháp tiến hành:
Thành phần trong 1.000 mL môi trường Urea 20 g Yeast extract 0,1 g Na2HPO4 9,5 g K2HPO4 9,1 g Phenol red 0,01 g Chỉnh pH đến: 6,7 ± 0,2
Cho vào mỗi ống nghiệm 5 mL môi trường.
Khử trùng môi trường và ống nghiệm ở 115ºC trong 15 phút.
Chủng các chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm có chứa môi trường Chistensen urea broth.
Ủ ở 30ºC trong 24 giờ.
Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ sẫm. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
* Xác định khả năng phân giải gelatine
- Mục đích: Xác định khả năng phân giải gelatine của các chủng nấm men có enzym gelatinase.
- Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị môi trường gelatine:
Thành phần trong 1.000 mL môi trường:
Peptone 5 g
Gelatine 120 g
Yeast extract 3 g
Chỉnh pH đến: 6,8 ± 0,2
Hút 3-5 mL môi trường vào mỗi ống nghiệm
Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121ºC trong 20 phút.
Chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm có chứa môi trường gelatine. Ủ ở 30ºC trong 48 giờ.
Sau 48 giờ ủ, tiếp tục ủ ở 20ºC trong 24-48 giờ
Kết quả dương tính khi môi trường trong ống nghiệm lỏng. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
Quan sát bằng mắt thường và ghi nhận kết quả.
3.2.3. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men
Mục đích: Khảo sát lượng CO2 sinh ra của các chủng nấm men trong quá trình lên men để xác định tốc độ lên men.
Phương pháp tiến hành
Nuôi tăng sinh các chủng nấm men được chọn. Ủ ở 30ºC trong 24 giờ.
Chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch đường glucose 2% đã được khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.
Lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham.
Đo chiều cao cột khí trong ống Durham sau 12, 18, 24, 30, 36, 42 và 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30ºC để xác định khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men.
Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
Tuyển chọn các chủng nấm men có hoạt tính lên men để thử nghiệm khả năng chịu nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau.
3.2.4. Khảo sát khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men
Mục đích: Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển trong môi trường có ethanol.
Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm 2 nhân tố (chủng nấm men và nồng độ ethanol) với 3 lần lặp lại. Cấy ria các chủng nấm men phân lập được trên đĩa petri có chứa môi trường
YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết 0%, 3%, 6%, 9% và 12% v/v. Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ 30ºCtừ 1 đến 4 ngày.
Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men khác nhau trên đĩa thạch. Chỉ có các chủng nấm men chịu được ethanol mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường có ethanol.
Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to, tròn của các chủng nấm men ở điều kiện môi trường có ethanol trong thời gian từ 1 đến 4 ngày.
Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển ở môi trường có ethanol.
3.2.5. Khảo sátkhả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men
Mục đích: Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao.
Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm 2 nhân tố (chủng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp lại.
Cấy ria các chủng nấm men phân lập được trên đĩa petri có chứa môi trường YPD agar.
Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 35, 37, 40, 43, 45ºC từ 1 đến 4 ngày.
Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men khác nhau trên đĩa thạch. Chỉ có các chủng nấm men chịu nhiệt mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc ở nhiệt độ cao.
Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to, tròn của các chủng nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao trong thời gian từ 1 đến 4 ngày. Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao.
3.2.6. Khảo sátkhả năng lên men ethanol của các chủng nấm men
Mục đích: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men ethanol mạnh.
Phương pháp tiến hành
Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108 tế bào/mL.
Chuẩn bị dịch rỉ đường 22Brix, thanh trùng rỉ đường bằng NaHSO3 (liều lượng 146 mg/L) trong 2 giờ. Xác định độ pH của dung dịch rỉ đường.
Cho 99 mL dung dịch rỉ đường nồng độ 22ºBrix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.
Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã được nuôi cấy vào các bình tam giác, mật số nấm men khi chủng là 106
tế bào/mL.
Ủ 4-7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở các nhiệt độ 30ºC, 35ºC, 37ºC, 39ºC và 42oC.
. Đếm bọt khí sinh ra trong 2 phút sau 24 giờ.
Đo độ Brix và pH. Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC.
Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol: nồng độ ethanol thu được sau lên men ở nhiệt độ cao.
Tuyển chọn các chủng nấm men cho nồng độ ethanol cao ở nhiệt độ cao.
3.2.7. Phƣơng pháp phân tích thống kê
Số liệu sẽ được phân tích bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV, USA.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢI LUẬN
4.1. Phân lập nấm men
Phân lập được 20 chủng nấm men từ 6 mẫu men bánh mì (Ins, Mau, CT, TM, ML, MN) từ 3 địa điểm khác nhau trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Các chủng nấm men được phân lập từ những dạng men thương mại được bán thị trường (men khô, men tươi, men ngọt và men lạt). Tên các chủng phân lập và địa điểm thu mẫu được trình bày trong Bảng 4.
Bảng 4.Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu và tên các chủng phân lập
STT Tên
chủng
Tên mẫu Địa điểm thu mẫu
1 Ins 1 Men khô Ins Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 2 Ins 2 Men khô Ins Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 3 Ins 3 Men khô Ins Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 4 Mau 1 Men khô Mau Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 5 Mau 2 Men khô Mau Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 6 Mau 3 Men khô Mau Phòng thực phẩm Viện NC và PT Công nghệ Sinh học 7 CT1 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ
8 CT2 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 9 CT3 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 10 CT4 Men tươi CT Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 11 TM1 Men tươi Mau Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 12 TM2 Men tươi Mau Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 13 TM3 Men tươi Mau Huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ 14 ML1 Men lạt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 15 ML2 Men lạt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 16 ML3 Men lạt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 17 MN1 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 18 MN2 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 19 MN3 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ 20 MN4 Men ngọt Siêu thị Co.op mart thành phố Cần Thơ
4.2. Xác định hình thái sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men
Theo Nguyễn Đức Lượng et al. (2003), có thể định danh sơ bộ các chủng nấm men dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men. Đặc điểm hình thái bao gồm mô tả hình thái tế bào nấm men khi nuôi cấy trên môi trường YPD
agar 2 ngày. Đặc điểm sinh lý bao gồm khả năng lên men đường, khả năng đồng hóa urea và khả năng phân giải gelatine.
4.2.1. Đặc điểm hình thái
Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc được ghi nhận từ các khuẩn lạc được cấy trên môi trường YPD sau 48 giờ ủ ở 30ºC. Nhìn chung, các chủng nấm men có sự khác biệt tương đối về đặc điểm bề mặt, dạng bìa, kích thước và màu sắc. Quan sát chó thấy 11 chủng nấm men có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục; 6 chủng nấm men có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục, bóng; 2 chủng nấm men có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng sữa và 1 chủng nấm men dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục, ngà. Về độ nổi khuẩn lạc, có 14 chủng nấm men với bề mặt khuẩn lạc trơn láng và 6 chủng nấm men với bề mặt khuẩn lạc sần. Dạng bìa cũng khá đa dạng, có 10 chủng nấm men dạng bìa nguyên, 4 chủng nấm men dạng bìa sợi, 3 chủng nấm men dạng bìa răng cưa, 2 chủng nấm men dạng bìa nguyên tỏa tia và 1 chủng nấm men có dạng bìa chia thùy.
Hình dạng của một số khuẩn lạc điển hình của các chủng nấm men được thể hiện ở Hình 7.
Hình 7. Hình dạng khuẩn lạc của một số chủng nấm men
Đặc tính hình thái tế bào của 20 chủng nấm men được kiểm tra dưới kình hiển vi (vật kính X100) cho thấy hình dạng chủ yếu của các tế bào nấm men bao gồm: hình cầu lớn, oval lớn, oval nhỏ, hình trụ, hình elip, elip dài và oval lớn dạng chùm. Các
TM2 CT4 Mau 3 ML1
đặc điểm hình thái và kích thước của khuẩn lạc và hình dạng tế bào nấm men được thể hiện trong Bảng 5.
Bảng 5. Đặc điểm hình thái và kích thƣớc của khuẩn lạc và hình dạng tế bào nấm men
STT Tên chủng
Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào
Đƣờng kính
(mm) Hình dạng, bề mặt và dạng bìa Màu sắc Hình dạng
1 Ins 1 2,5-3,5 Hình tròn, sần, bìa sợi Trắng đục Elip dài 2 Ins 2 3,5-4,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Hình trụ 3 Ins 3 1,5-2,5 Hình tròn, trơn,
bìa nguyên
Trắng sữa Cầu lớn
4 Mau 1 1,5-2,5 Hình tròn, sần, bìa sợi Trắng đục Oval lớn 5 Mau 2 2,5-3.5 Hình tròn, sần, bìa răng cưa Trắng đục Oval lớn 6 Mau 3 2,0-3,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục, bóng Oval nhỏ
7 CT1 3,5-4,5 Hình tròn, sần,
bìa chia thùy
Trắng đục Hình trụ 8 CT2 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Oval lớn 9 CT3 2,0-3,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Elip dài 10 CT4 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục, bóng Oval nhỏ 11 TM1 2,5-3,0 Hình tròn, trơn, bìa sợi Trắng đục Oval lớn 12 TM2 3,5-4,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Cầu lớn
13 TM3 1,5-2,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục, bóng Elip 14 ML1 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên, tỏa tia Trắng đục, bóng Elip 15 ML2 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa răng cưa Trắng đục Elip 16 ML3 2,5-3,5 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục Oval lớn dạng
chùm 17 MN1 2,0-3,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên, tỏa
tia
Trắng đục, bóng Cầu lớn
18 MN2 1,0-2,0 Hình tròn, trơn, bìa nguyên Trắng đục,bóng Elip dài
19 MN3 3,5-4.5 Hình tròn, sần,
bìa răng cưa
Trắng đục, ngà Oval lớn
20 MN4 1,0-2,0 Hình tròn, sần, bìa sợi Trắng sữa Elip dài
Hình dạng tế bào của 20 chủng nấm men cũng khá đa dạng, có 5 chủng nấm men với hình dạng oval lớn, 4 chủng nấm men hình dạng elip dài, 3 chủng nấm men
dạng hình elip, 3 chủng nấm men có dạng hình cầu lớn, 2 chủng nấm men dạng hình oval nhỏ, 2 chủng nấm men có dạng hình trụ và 1 chủng nấm men có hình tế bào oval lớn dạng chùm.
Một số hình dạng chủ yếu của các nhóm tế bào được thể hiện ở Hình 8.
Hình 8. Hình dạng điển hình của 7 nhóm nấm menở vật kính X100
Ghi chú: A: Oval lớn (TM1), B: Oval nhỏ (Mau 3), C: Elip dài (MN4), D: Hình trụ (Ins 1),
E: Oval lớn dạng chùm (ML3), F: Cầu lớn (Ins 3), G: Hình elip (TM3)
Dựa vào đặc điểm hình thái của các tế bào nấm men, có thể chia 20 chủng nấm men thành 7 nhóm chính được tổng hợp trong Bảng 6.
Bảng 6. Tổng hợp các dạng tế bào của 20 nấm men phân bố ở 3 địa điểm