Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2.
Hình 6. Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2
(*Norr et al., 2003)
Quá trình lên men rượu được chia làm hai thời kỳ chính:
- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối.
- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2.
Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Thông thường, khi lên men, lượng nấm men phải lớn hơn 10 triệu/1 mL dung dịch lên men. Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong, tạo ra rượu và CO2.
Rượu etylic tạo thành sẽ khuyếch tán ra bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên tốc độ khuyếch tán rất nhanh. CO2 cũng hòa tan trong môi trường nhưng tốc độ hòa tan không lớn và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa. Khi đó, CO2 bám xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên thành
túi lớn, đến lúc nào đó sẽ có sự chênh lệch về khối lượng riêng giữa môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên. Khi nổi lên, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho CO2 phóng thích ra bên ngoài. Lúc này, khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng chìm xuống. Quá trình tế bào nấm men nổi lên rồi chìm xuống diễn ra liên tục làm cho nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang thái động, gia tăng khả năng tiếp xúc của tế bào với môi trường, gia tăng tốc độ lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2004).
Trong giai đoạn lên men phụ, sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan. Do đó, tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào khả năng thủy phân hàm lượng dextrin (không lên men) còn lại. Như vậy, chu kì lên men dịch đường phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng càng kéo dài thời gian lên men cuối thì hiệu suất quá trình lên men càng tăng.
2.5.3. Các yếu tố chính ảnh hƣởng đến quá trình lên men ethanol 2.5.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng
Nguyên liệu chính của quá trình lên men là glucid, nên nồng độ đường ảnh hưởng lớn đến hiệu suất lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ đường phù hợp từ 10-15%. Nồng độ đường quá cao ức chế nấm men và năng lực lên men rượu giảm. Khi nồng độ đường 30-35% sự lên men gần như đình chỉ. Nếu nồng độ đường quá thấp, khả năng lên men cũng giảm. Những nấm men chịu được nồng độ rượu cao là những nấm men chịu được áp suất thẩm thấu đường mạnh. Khi gia tăng nồng độ đường sẽ kéo dài thời gian lên men và hiệu suất rượu từ một đơn vị đường giảm, lượng rượu tạo ra không đáng kể. Nguyên nhân là phần lớn các tế bào nấm men bị chết do hiện tượng co nguyên sinh.Ngoài ra, sự lên men trong môi trường có nồng độ đường cao dẫn đến hiện tượng acid bay hơi sinh ra nhiều. Để tránh điều này cũng như để gia tăng hiệu suất rượu cần cho đường từ từ vào (Nguyễn Công Hà, 2000) Đối với thí nghiệm khảo sát khả năng lên men rượu của nấm men từ rỉ đường mía – phế phẩm thu được của công nghiệp ép mía thành đường sau khi đã thu saccharose, cần xử lý rỉ đường trước khi đưa vào sử dụng làm môi trường nuôi cấy trong quá trình lên men. Nguyên liệu rỉ đường thường có từ 35-40% là đường. Trước khi lên men phải pha loãng xuống từ 14-20%.
2.5.3.2. Dinh dƣỡng
Nitơ và nguồn carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men. Sự tương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Các chất bổ sung vào môi trường có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm giảm sinh khối và sản sinh ethanol (Helena de Cruz et al., 2003).
2.5.3.3. Ảnh hƣởng của oxy
Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pastuer: kìm hãm sự lên men rượu bằng oxy. Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Với sự có mặt của oxy nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn acid lactic, acid acetic,…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu 2 chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển).
Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm va dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên lại có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy.
2.5.3.4. Ảnh hƣởng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men rượu. Oxy như là một chất trao đổi, trong nồng độ xác định nó có tác dụng kìm hãm hoặc làm ngưng sinh sản của nấm men. Theo nghiên cứu của Miuler-Thurrau, khi: hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng thì việc sinh sản của nấm men đình trệ. Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 1,5% trọng lượng thì nấm men không còn sinh sản được nữa.
2.5.3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có sự phát triển tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với chủng ưu nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối là 35ºCvà nhiệt độ thích hợp cho sự lên men là 40ºC. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng giới hạn 28-32ºC. Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Nếu làm lạnh dịch đường từ 20-22ºC sẽ hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Sau 8-10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng lên 28- 30ºC. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh chóng nhưng chủ yếu là nhiễm vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại, sản phẩm tạo ester và aldehyde. Ở nhiệt độ 30ºC, nấm men dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38ºC chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần.
Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men. Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28-30ºC. Nhiệt độ khoảng hơn 50ºC và dưới 0oC thì sự lên men hầu như bị đình trệ. Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũng như ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm.
2.5.3.6. Ảnh hƣởng của pH
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2,0-8,0 nhưng thích hợp nhất là 4,0-4,5; thích hợp khoảng 4,8-5,2 để quá trình đường hóa diễn ra. Kết quả này phù hợp với quá trình ủ nấm men sẽ chuyển hóa đường thành rượu, môi trường rượu làm pH sẽ giảm dần, càng về sau lượng rượu sinh ra càng nhiều, do đó giá trị pH sau lên men là thấp nhất. Vi khuẩn phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn từ 3,8-4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loại vi khuẩn do quen dần (thuần hóa) với độ pH thấp nên ngoài việc điều chỉnh pH thích hợp còn phải sử dụng các chất sát trùng. Khi pH đạt 8,0 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là animo acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.
Nồng độ của ion H+ có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và
ảnh hưởng lên sự phát triển của nấm men. Năng suất lên men ethanol cao nhất thường dao động ở pH 4,5-4,7. Khi pH được điều chỉnh lên 7,0 hoặc cao hơn thì acid acetic được tạo thành acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al., 2001).
2.5.3.7. Ảnh hƣởng nồng độ ethanol
Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độ ethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men. Rượu tạo ra trong quá trình lên men có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men. Sản phẩm chủ yếu của quá trình kị khí là ethanol, ethanol kìm hãm hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên tùy theo nồng độ. Thông thường nấm men lên men đến nồng độ rượu đạt 12-14%. Một số ít nấm men có thể lên men đạt nồng độ rượu 17-20%. Với nồng độ rượu cao hơn sẽ ức chế nấm men và kìm hãm lên men rượu. Việc chọn lọc chủng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các chủng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men.
Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 chủng nấm men từ viên men rượu, chín chủng được chọn để khảo sát khả năng chịu cồn. Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy khả năng chịu đựng độ cồn trong khoảng 5-6% (w/v) ethanol và hai chủng có khả năng chịu đựng độ cồn thấp hơn từ 2,4-3,0% (w/v) ethanol.
2.5.3.8. Ảnh hƣởng nồng độ dịch lên men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác, đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại, nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và sẽ tốn hơi khi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.
Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10-18%, nồng độ đường lên cao sẽ ức chế sự nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30-35%, nồng độ đường thấp cũng làm giảm khả năng lên men.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1.Thời gian, địa điểm thực hiện
Thời gian: từ tháng 06/2014 đến tháng 12/2014.
Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên liệu
Thu được 6 mẫu nấm men thương mại ở 3 địa điểm.
3.1.3. Hóa chất
- Hóa chất thanh trùng: NaHSO3
Môi trường phân lập nấm men:
Agar (2%), Glucose (2%), Peptone (0,5%), yeast (0,5%), Tetracyline (10% dung dịch) (50 mg pha với 500 mL nước cất khử trùng).
Môi trường tăng sinh khối:
Glucose (2%), Peptone (0,5%), yeast (0,5%), Tetracyline (10% dung dịch) (50 mg pha với 500 mL nước cất khử trùng).
- Hóa chất khác: C2H5OH (cồn).
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
- Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ)
- Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)
- Tủ cấy vô trùng (TotelStar Bio-II-A, Tây Ban Nha)
- Tủ ủ (Herich, Đức)
- Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, Đức)
- Nồi khử trùng (Breukelen, Hà Lan)
- Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, BH-2, Nhật)
- Các dụng cụ thông dụng như: đèn cồn, kim cấy, ống nghiệm, bình tam giác, chai thủy tinh, ống đong, pipet, đĩa petri,…
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập các chủng nấm men từ nấm men thƣơng mại a) Thu mẫu
Thu thập mẫu từ các địa điểm: 2 mẫu của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm (men khô Mau và men khô Ins), 2 mẫu thu tại Huyện Vĩnh Thạnh (men tươi CT và men tươi Mau) và 2 mẫu thu ở siêu thị Co.op mart Cần Thơ (men lạt và men ngọt) .
b) Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy nấm men
Môi trường được pha đúng theo các thành phần trong công thức môi trường phân lập nấm men. Sau đó tiến hành khử trùng môi trường và đĩa petri bằng phương pháp nhiệt ướt ở 121ºC trong 20 phút. Kết thúc thời gian khử trùng, áp dụng thủ thuật vô trùng để rót môi trường vào đĩa petri (20 mL/đĩa) và để nguội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c) Nuôi tăng sinh
Các mẫu nấm men khác nhau cho vào các bình tam giác chứa môi trường tăng sinh khối (lỏng) nấm men. Sau đó đem ủ lắc ở nhiệt độ phòng (28-30ºC) trong khoảng 48 giờ.
d)Phân lập nấm men
Sau khi nuôi tăng sinh, tiến hành phân lập nấm men theo các bước sau:
- Dùng micropipet hút mỗi mẫu 1 mL cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước cất vô trùng. Lần lượt pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 101
, 102, 103 và 104 trong các ống nghiệm chứa nước cất vô trùng.
- Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm bằng máy vortex và hút 10 µL ở mỗi độ pha loãng của mỗi mẫu nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy nấm men.
- Dùng que trải trãi đều dung dịch trên đĩa bằng thủ thuật vô trùng.
- Ủ các đĩa petri sau khi phân lập trong tủ ủ ở nhiệt độ tự nhiên (28-30ºC) trong 48 giờ.
- Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men trên môi trường thạch.
- Bảo quản trong tủ lạnh ở 4ºC.
Có nhiều cách kiểm tra:
- Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc: màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu.
- Quan sát nấm men dưới kính hiển vi: làm tiêu bản từ dịch lên men, nhuộm đơn bằng xanhmethylen rồi quan sát với vật kính X100 (vật kính dùng dầu).
3.2.2. Xác định hình thái sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men a. Đặc điểm hình thái a. Đặc điểm hình thái
- Mục đích: Xác định các đặc tính về hình dạng và kích thước của khuẩn lạc và tế bào nấm men đã phân lập được. Kiểu nẩy chồi và hình thành bào tử của tế bào nấm men.
- Phƣơng pháp tiến hành:
Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (yeast extract, peptone, D-glucose, tetracyline, agar).
Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ.
Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.