a. Đặc điểm hình thái
- Mục đích: Xác định các đặc tính về hình dạng và kích thước của khuẩn lạc và tế bào nấm men đã phân lập được. Kiểu nẩy chồi và hình thành bào tử của tế bào nấm men.
- Phƣơng pháp tiến hành:
Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (yeast extract, peptone, D-glucose, tetracyline, agar).
Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ.
Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.
Làm tiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình dạng của tế bào và sử dụng trắc vi thị kính để đo kích thước tế bào nấm men.
b. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
* Kiểm tra khả năng lên men đường saccharose và maltose
+ Lấy 1 mL dung dịch nấm men đã được ủ sau 24 giờ cho vào chai Durham có chứa dung dịch saccharose 2% đã được khử trùng. Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham, ủ ở 30ºC.
+ Chỉ tiêu đánh giá: quan sát chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược sau 12, 24, 36 và 48 giờ ủ.
Thực hiện các bước tương tự đối với dung dịch đường maltose.
* Xác định hoạt tính phân giải urea
- Mục đích: Phát hiện nấm men có mang enzyme urease.
- Phương pháp tiến hành:
Thành phần trong 1.000 mL môi trường Urea 20 g Yeast extract 0,1 g Na2HPO4 9,5 g K2HPO4 9,1 g Phenol red 0,01 g Chỉnh pH đến: 6,7 ± 0,2
Cho vào mỗi ống nghiệm 5 mL môi trường.
Khử trùng môi trường và ống nghiệm ở 115ºC trong 15 phút.
Chủng các chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm có chứa môi trường Chistensen urea broth.
Ủ ở 30ºC trong 24 giờ.
Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ sẫm. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
* Xác định khả năng phân giải gelatine
- Mục đích: Xác định khả năng phân giải gelatine của các chủng nấm men có enzym gelatinase.
- Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị môi trường gelatine:
Thành phần trong 1.000 mL môi trường:
Peptone 5 g
Gelatine 120 g
Yeast extract 3 g
Chỉnh pH đến: 6,8 ± 0,2
Hút 3-5 mL môi trường vào mỗi ống nghiệm
Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121ºC trong 20 phút.
Chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm có chứa môi trường gelatine. Ủ ở 30ºC trong 48 giờ.
Sau 48 giờ ủ, tiếp tục ủ ở 20ºC trong 24-48 giờ
Kết quả dương tính khi môi trường trong ống nghiệm lỏng. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
Quan sát bằng mắt thường và ghi nhận kết quả.