Sau khi hoàn thành quá trình khảo sát và đánh giá phƣơng pháp, chúng tôi đã ứng dụng phƣơng pháp để phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng mua ở các hiệu thuốc tại Hà nội. Các mẫu đƣợc đồng nhất và phân tích theo quy trình chiết mẫu đã đƣợc tối ƣu, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.15:
Bảng 3.15: Bảng kết quả phân tích mẫu thực
Mẫu Aconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnin mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên
Gout Kingphar KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH
Gout Hoàng Tiên Đan KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Gout Tâm Bình KPH KPH 0,12 KPH KPH KPH KPH 0,23 Gout Thanh Bình KPH KPH 0,019 KPH KPH KPH KPH 0,035 Artrex DS KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Jex KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Cốt thoái vƣơng KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Xƣơng khớp Su Tong KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Kiện cốt hoàn KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Xƣơng khớp Makong KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Thấp khớp Tuệ Linh KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Xƣơng khớp Bạch Xà KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Viên khớp Tâm Bình KPH KPH 0,079 KPH KPH KPH KPH 0,14
Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin
Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin
Nhận xét: Trong 13 mẫu thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc đƣợc
mua tại các hiệu thuốc tại Hà Nội thì có 3 mẫu có chứa brucin và strychnin là hai chất của cây mã tiền. Hàm lƣợng cao nhất là trong viên guot Tâm Bình với hàm lƣợng brucin 0,12 mg/viên và strychnin 0,23 mg/viên với liều dùng 2 lần/ ngày mỗi lần 3 viên thì hàm lƣợng này ở mức an toàn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu xác định hàm lƣợng nhóm Alkaloid độc trong thực phẩm chức năng cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:
1. Nghiên cứu và tối ƣu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ để xác
định 8 Alkaloid bao gồm:
- Tối ƣu các điều kiện khối phổ (xác định thế đầu phun, năng lƣợng bắn, tốc độ khí...) để thu đƣợc các mảnh phổ đặc trƣng của từng Alkaloid.
- Tối ƣu các điều kiện sắc ký lỏng: cột sắc ký Cột sắc ký InertSustain C18 (150mm × 4,6mm × 5μm); pha động: kênh A amoniacetat 10 mM trong nƣớc, kênh B là acetonitril; chƣơng trình rửa giải gradient; tốc độ dòng 0,5 ml/phút.
2. Tối ƣu điều kiện để tách chiết các Alkaloid ra khỏi nền mẫu: dung môi chiết
ethylacetat và chlorofom, kiềm hóa bằng 1mL NH4OH 5%
3. Xây dựng khoảng tuyến tính từ 5÷1000 ng/mL với các chất brucin, strychnin,
koumin, aconitin, colchicin, khoảng tuyến tính từ 0,5 ÷ 100 ng/mL với các chất nicotin, atropin, scopolamin và đƣờng chuẩn xác định 8 Alkaloid đều có hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 > 0,99. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện nhỏ 1÷ 10 µg/kg, độ thu hồi từ 80,1 ÷ 110 % và RSD từ 1,9 ÷ 9,6 đều đạt yêu cầu của Châu Âu.
4. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích 13 mẫu thực phẩm chức năng trên địa
bàn Hà Nội phát hiện 3 mẫu có chứa brucin và strychnin không có mẫu nào nhiễm các Alkaloid còn lại.
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp phân tích có độ nhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích hàm lƣợng 8
Alkaloid với độ tin cậy cao. Chúng tôi sẽ tiếp tục mở rộng phƣơng pháp để phân tích đƣợc thêm các độc tố nhóm Alkaloid.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu thêm quy trình phân tích đồng thời các alkaloid độc khác trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc trên hệ thống LC- MS/MS.
Hiện nay tại Việt Nam chƣa có quy định về hàm lƣợng cũng nhƣ giới hạn
các alkaloid độc này. Cơ quan quản lý nên có các quy định về hàm lƣợng các alkaloid độc này trong thực phẩm chức năng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêu
chuẩn nguyên liệu và bán thành phẩm cà độc dƣợc sử dụng trong chế phẩm Camat", tạp chí Dƣợc học,421,tr.45-49.
2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Khoa dƣợc (2008), "Giáo trình dƣợc liệu", tập II, NXB ĐH Y Dƣợc TP.HCM. 4. Phạm Thanh Kỳ (1998), "Bài giảng dƣợc liệu", tập II, NXB Đại học Dƣợc Hà
Nội.
5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.
6. Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH
Quốc Gia Hà Nội.
7. Lƣơng Thị Phấn (2014), Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin
trong huyết tương bằng phương pháp HPLC, khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng
Đại học Dƣợc Hà nội.
8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
9. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa
học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
10.Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa
học trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
11.Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011), "Nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúc alkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Thừa Thiên Huế", tạp chí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230.
14.Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất bản Y học
15.TS. Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam , Bài giảng công nghệ tách chiết các
hợp chất thứ sinh.
16. Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, NXB khoa học kỹ thuật.
17. Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, NXB khoa học kỹ thuật.
18. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định phƣơng pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Tiếng Anh
19.AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method
verification, USA
20.Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS
Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar of Datura Species”, Journal of Chromatographia, 58, 1–37.
21.Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS in
medicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 55, 744-757. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
22.Hua-Tao Feng, Sam F.Y Li (2002), “Deterrmination of five toxic alkaloids in
two common herbal medicines with capillary electrophoresis”, Journal of
Chromatography A, 1-2, 243–247
23.Huiqin Wu, Xiaoting Xiong, Xiaolan Huang, Zhixin Zhu (2013), “
Simultaneous deterrmination of 17 toxic alcaloids in human fluids by liquid chromatography coupled whith electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 36:9, 1149-1162.
24.Goodman, L. (2006), “Goodman & Gilman's the pharmacological basis of
25.José Diana Di Mavungu, Svetlana V. Malysheva, Melanie Sanders, Daria Larionova (2012), “Development and validation of a new LC–MS/MS method for the simultaneous deterrmination of six major ergot alcaloids and their corresponding epimers. Application to some food and feed commodities”,
Food Chemistry, 135, 292–303.
26.Miao Li, Xiao-Fang Holi, Jie Zhang, Si-Cen Wang, Qiang Fu, Lang-Chong He
(2011), “Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinese medicines”, Journal of Pharmacertical Analysis, 1:2, 81- 91.
27.Lounasmaa M.; Tamminem T.(1993), The Alkaloids, Academic Press: New
York, 114.
28.Peihong Qiu, Xiaohong Chen, Xiang Chen (2008), “Simultaneous
deterrmination of five toxic alkaloids in body fluids by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass
spectrometry”, Journal of Chromatography B, 875(2), 471–477
29.R.E. Ardrey (2003), “Liquid chromatography-mass spectrometry: an
introduction”, New York, J. Wiley.
30.Somenath Mitra (2003), “Sample Preparation Techniques in Analytical
Chemistry’’, John Wiley & Sons.
31.Tadeusz Aniszewski (2012), Alcaloids - Secrets of Life, Alkaloid Chemistry, Biological Significance and applications and ecological Role, Elsevier Science.
32.Xie Y, Jiang ZH, Zhou H, Xu HX, Liu L (2005), “ Simultaneous
deterrmination of six Aconitum alkaloids in proprietary Chinese medicines by
high-performance liquid chromatography’’, Journal Chromatography A,
1093(1-2), 195-203.
33.Kang XQ1, Fan ZC, Zhang ZQ (2010), “Simultaneous deterrmination of three
Aconitum alkaloids in six herbal medicines by high-performance liquid
34.Yu L, Xu Y, Feng H, Li SF (2005), “Separation and deterrmination of toxic pyrrolizidine alkaloids in traditional Chinese herbal medicines by micellar
electrokinetic chromatography with organic modifier’’, Electrophoresis,
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Khảo sát pha động (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình P1.1: Kết quả diện tích píc của các alkaloid khi sử dụng các hệ pha động khác nhau
XIC of +MRM (18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 from Sample 7 (Std Mix5-50ppb-CH3COONH4-5mM) of DataSET2.wiff (Turbo Spray... Max. 1.7e5 cps. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 Time, min 0.00 5.00e4 1.00e5 1.50e5 2.00e5 2.50e5 3.00e5 3.50e5 4.00e5 4.50e5 5.00e5 5.50e5 6.00e5 6.50e5 7.00e5 7.50e5 8.00e5 8.50e5 9.00e5 9.50e5 1.00e6 1.05e6 1.09e6 Int en sit y, cp s 9.63
Hình P1.3: Sắc đồ các alkaloid tại nồng độ amoniacetat trong pha động là 5mM XIC of +MRM (18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 from Sample 5 (Std Mix5-50ppb-Grad7) of DataSET2.wiff (Turbo Spray) Max. 2.0e5 cps.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 Time, min 0.00 5.00e4 1.00e5 1.50e5 2.00e5 2.50e5 3.00e5 3.50e5 4.00e5 4.50e5 5.00e5 5.50e5 6.00e5 6.50e5 7.00e5 7.50e5 8.00e5 8.50e5 9.00e5 9.50e5 1.00e6 1.05e6 Int en sit y, cp s 9.70
Hình P1.4: Sắc đồ các alkaloid tại nồng độ amoniacetat trong pha động là 10mM XIC of +MRM (18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 from Sample 9 (Std Mix 5-50ppb-CH3COONH4-20mM) of DataSET2.wiff (Turbo Spra... Max. 2.0e5 cps.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 5.0e5 5.5e5 6.0e5 6.5e5 7.0e5 7.5e5 8.0e5 8.5e5 9.0e5 9.5e5 Int en sit y, cp s 9.81
Phụ lục 2: Tối ƣu quá trình xử lý mẫu
Hình P2.3: Sắc đồ colchicin khi khảo sát dung môi chiết
Hình P2.5: Sắc đồ scopolamin khi khảo sát dung môi chiết
Hình P2.7: Sắc đồ aconitin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa
Hình P2.9: Sắc đồ brucin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa
Hình P2.11: Sắc đồ koumin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa
Hình P2.13: Sắc đồ scopolamin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa
Hình P2.15: Sắc đồ aconitin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa
Hình P2.17: Sắc đồ brucin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa
Hình P2.19: Sắc đồ koumin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa
Hình P2.21: Sắc đồ scopolamin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa
Phụ lục 3: Đánh giá phƣơng pháp phân tích
Hình P3.1: Sắc đồ aconitin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg
Hình P3.3: Sắc đồ colchicin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg
Hình P3.5: Sắc đồ nicotin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 50 µg/kg
Hình P3.7: Sắc đồ strychnin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg
Hình P3.9: Sắc đồ brucin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg
Hình P3.11: Sắc đồ koumin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg
Hình P3.13: Sắc đồ strychnin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg
Hình P3.17: Sắc đồ koumin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 2 mg/kg
Bảng P3.1: Độ lệch chuẩn tƣơng đối lặp lại tối đa theo từng khoảng nồng độ Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 100 1 100% 1,3 10 10-1 10% 1,8 1 10-2 1% 2,7 0,1 10-3 0,1 % 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 1 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10 ppb 21 0,0000001 10-9 1 ppb 30
Bảng P3.2: Khoảng chấp nhận của độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau
Hàm lƣợng [%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%]
100 1 100% 98-102 10 10-1 10% 98-102 1 10-2 1% 97-103 0,1 10-3 0,1 % 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 1 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phụ lục 4: Phân tích mẫu thực
Hình P4.2: Sắc đồ mẫu Gout Hoàng Tiên Đan không phát hiện alkaloid
Hình P4.3: Kết quả mẫu phát hiện strychnin