Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ phận phát hiện nhân electron.
1.3.3. Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS
Đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách sắc ký là thời gian lƣu của các chất do vậy
dựa vào thời gian lƣu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thể định tính từng chất trong hỗn hợp. Dùng phƣơng pháp đƣờng chuẩn và thêm chuẩn để định lƣợng chất phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm soát độ thu hồi của phƣơng pháp.
1.4.Lấy mẫu
Lấy mẫu: Lƣợng mẫu lấy phải đảm bảo nhu cầu phân tích, phù hợp phân tích định lƣợng, giữ nguyên hiện trạng và đúng thành phần
Cách bảo quản mẫu: Quá trình bảo quản mẫu phải đảm bảo sao cho không làm nhiễm bẩn hoặc mất chất phân tích. Mục đích để giữ và bảo toàn đƣợc chất phân tích do các hiện tƣợng tƣơng tác hóa học, tự phân hủy chất [30].
1.5.Đánh giá phƣơng pháp phân tích
Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất.
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một qui trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc.
Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này do thiết bị sắc ký có kết nối detercter MS nên chúng tôi sử dụng các phƣơng pháp:
So sánh phổ của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và
mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu trên mẫu chuẩn.
Phƣơng pháp xác nhận (confirmation method). Theo AOAC điểm
nhận dạng IP (identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con.
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu
có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.
Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu
Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đƣờng (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích (n=4). Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3, LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10. Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ
thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.
Đường chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng
đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.
Để xác định khoảng tuyến tính ngƣời ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đƣờng cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu đƣợc vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính [10][18].
Có thể xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hƣởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ số đầu tiên của một đƣờng chuẩn đạt yêu cầu và hệ số tƣơng quan hồi quy (Coefficient of corelation), giá trị R phải đạt yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤1.
Độ lặp lại và độ thu hồi.
Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và đƣợc biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%):
Trong đó:
xi: Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i.
x: Nồng độ trung bình tính đƣợc của n lần thử nghiệm. n: Số lần thử nghiệm.
Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng dƣới dạng độ thu hồi (recovery). Độ thu hồi (đánh giá độ đúng) là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết [10][18].
R(%) = f a .100 C С (3). Trong đó: R: độ thu hồi (%)
Cf : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng xác định đƣợc (ng/ml). Ca : Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu trắng (ng/ml).
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc do các alkaloid độc trong thực phẩm chức năng có
nguồn gốc thảo dƣợc đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần có phƣơng pháp xác định chính xác các alkaloid độc để quản lý và cảnh báo đảm bảo an toàn và sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng một số alkaloid độc bao gồm (Brucin, Strychnin, Aconitin, Colchicin, Atropin, Scopolamin, Nicotin, Koumin) trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS.
Mục tiêu tiến hành nghiên cứu của đề tài:
Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định đồng thời
các alkaloid.
Khảo sát, tối ƣu hóa quá trình xử lý mẫu.
Thẩm định phƣơng pháp phân tích.
Ứng dung phƣơng pháp để phân tích trên một số mẫu thực tế.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp nghiên cứu của luận văn này bao gồm:
Phƣơng pháp tách chiết mẫu:
Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên chúng tôi lựa phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng. Mẫu đƣợc thêm dung dịch kiềm để chuyển các alkaloid về dạng bazơ sau đó các alkaloid đƣợc chiết vào pha dung môi hữu cơ.
Phƣơng pháp LC-MS/MS:
Mẫu sau khi tách chiết đƣợc đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion dƣơng nguồn ESI, cơ sở lý thuyết đã đƣợc nêu trong phần tổng quan. Các kết quả đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex).
Phƣơng pháp thẩm định:
Để đánh giá phƣơng pháp chúng tôi tiến hành theo quy định của AOAC. Phƣơng pháp thẩm định bao gồm:
- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
- Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Độ lặp lại và độ thu hồi
Phƣơng pháp lấy mẫu:
Đối tượng mẫu: Một số thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược Phương pháp lấy mẫu: Ngẫu nhiên
Địa điểm: Một số hiệu thuốc trên địa bàn nội thành Hà Nội
2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.3.1 Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm:
+ Máy sắc ký lỏng của Shimadzu. Model 20 AD-UFLC. + Máy khối phổ. Model AB sciex Triplequard 5500
- Cột sắc ký InertSustain C18 (150mm × 4,6mm × 5μm). Nƣớc sản xuất Nhật
Bản
- Máy lắc xoáy ( vortex) VELP.
- Máy đồng nhất mẫu.
- Máy ly tâm MIKRO 22R có thể đạt đƣợc tốc độ tối thiểu 4000 rpm với ống ly
tâm 50 mL.
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) (Metter Toledo).
- Máy cất quay chân không có bể điều nhiệt EYELA
- Ống đong dung tích 10,50, 100 mL.
- Autopipet loại 100 µL, 1000 µL, 5000 µL,và đầu côn tƣơng ứng.
- Ống ly tâm 50 mL.
- Màng lọc 0,2 µm.
- Vial loại 1,8 mL.
- Bình định mức dung tích 10, 25, 50, 100, 500 mL.
- Ống nghiệm thủy tinh có nắp 6mL
2.3.3 Chất chuẩn
- Các chất chuẩn: Nicotin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn
độ tinh khiết 98,7 % lọ 1 g; Koumin cung cấp bởi hãng Chengdu Biopurify ở dạng rắn độ tinh khiết 99,72 % lọ 10 mg; Atropin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99 % lọ 1 g; Scopolamin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99,3 % lọ 1 g; Brucin và Strychnin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 98% lọ 5g; Aconitin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 95 % lọ 5 mg; Colchicin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 95 % lọ 100 mg
- Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/mL: cân chính xác 0,01g từng chất chuẩn trên
cân phân tích có độ đọc 0,0001g, hòa tan và định mức 100 mL bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin và atropin (10
µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất vào bình định mức 10 mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tháng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (1-10 µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của brucin, strychnin, koumin, aconitin, colchicin và 1 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin, atropin (10 µg/mL) vào bình định mức 10 mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tuần.
- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1-10 µg/mL trong methanol để thu đƣợc các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50; 10-100; 20-200; 50-500; 100-1000; 200-2000; 500-5000 ng/mL.
2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác
- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck 98%), acid acetic băng (Merck), amoniacetat (Merck), ethylacetat (Merck), ether (Merck), chloroform (Merck), NaOH (Merck), acid boric, …
- Nƣớc cất hai lần
- Dung dịch NaOH 0,1M: Cân 2g NaOH hòa tan và định mức bằng 500 mL nƣớc cất hai lần.
- Dung dịch KCl 0,1M: Cân 7,455g KCl hòa tan và định mức bằng 1000 mL
nƣớc cất hai lần.
- Dung dịch đệm borat pH 9: Cân 3,09 g acid boric hòa tan hòa tan bằng 500
mL dung dịch KCl 0,1M. Thêm tiếp 210 mL dung dịch NaOH 0,1M.
- Dung dịch NH4OH 5%: hút chính xác 5 mL dung dịch NH4OH vào bình 100
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS
3.1.1. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS)
3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ và ion con
Qua tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành khảo sát xác định các alkaloid
bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu hóa điều kiện khối phổ, dùng kim bơm hỗn hợp các chất chuẩn 50 ng/mL tiêm trực tiếp vào detector khối phổ để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất để chọn đƣợc ion mẹ, ion con dùng để định lƣợng và định tính đối với từng chất và các điều kiện bắn phá tƣơng ứng của từng mảnh nhƣ trong bảng :
Bảng3.1: Các mảnh ion định lượng và định tính của các alkaloid
Tên chất phân tích Mảnh mẹ (m/z) Mảnh con (m/z) CE (eV) CXP (V) Ghi chú Brucin 395 324 41 34 Định lƣợng 244 47 34 Định tính Strychnin 335,2 184,2 51 18 Định lƣợng 156 53 20 Định tính Aconitin 646,2 586,2 43 34 Định lƣợng 526,2 51 28 Định tính Atropin 290 124 29 20 Định lƣợng 93 37 14 Định tính Scopolamin 304 138 29 18 Định lƣợng 156 21 20 Định tính Koumin 307 180 57 22 Định lƣợng 204 63 24 Định tính Colchicin 400 358 27 46 Định lƣợng 310 33 20 Định tính Nicotin 163 132 19 18 Định lƣợng 130 29 24 Định tính
Trong đó:
+ CXP (Collision Cell Exit Potential): Thế áp giữa bộ tứ cực Q2 và Q3.
+ CE (Collision Energy): Là năng lƣợng va chạm đƣợc tạo ra do thế áp vào bộ tứ cực Q2, tạo ra năng lƣợng để phân mảnh ion mẹ.
Mảnh ion con m/z có cƣờng độ lớn nhất dùng để định lƣợng, mảnh con thứ 2 có cƣờng độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích.
Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin
Kết luận: Sau khi tiến hành khảo sát, chúng tôi chọn đƣợc ion mẹ và ion con thích hợp cho các độc tố alkaliod tại các điều kiện MS nhƣ ở bảng 3.1.
3.1.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện MS
Để tối ƣu hóa điều kiện MS cho từng chất, chúng tôi sử dụng kỹ thuật FIA,
nghĩa là hỗn hợp chuẩn đƣợc bơm trực tiếp váo máy MS cùng với dòng pha đô ̣ng mà không qua cô ̣t sắc ký với điều kiện nhƣ sau : Pha động là dung dịch amoniacetat
10 mM trong nƣớc : methanol (80:20), hỗn hợp chuẩn có nồng độ 50 ng/mL, thể tích bơm 10 µL, thời gian 1 phút.
Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lƣợng và định tính của từng chất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion.
+ IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này đƣợc áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phận phân tích ion. Thế này sẽ quyết định loại ion chuyển đến bộ phận phân tích khối. Đối với loại ion dƣơng 4000 – 5500V.
+ GS1 (Ion Source Gas 1): Tạo áp suất khí hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự hình thành nên các giọt đƣợc dễ dàng hơn. Tốc độ khí của Gas 1 thƣờng cao hơn so với Gas 2.
+ TEM ( Temperature): Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (Gas2). Nó thúc đẩy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun.
+ GS2 (Ion Source Gas 2): Tạo áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi, tăng hiệu quả của quá trình ion hóa.
+ CUR (Curtain Gas): Luồng khí N2 tinh khiết đƣợc thổi vào khe giữa 2 màn chắn của bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích phổ. Nó có tác dụng đẩy các giọt dung môi và các phân tử trung hòa, để giữ cho Q0 (nguồn ion mẹ ) sạch hơn.
Các thông số của bộ phận phân phân tích khối: + DP, CE, CXP nhƣ đã giải thích ở trên.
+ EP (Entrance Potential): Thế áp vào nguồn ion mẹ Q0.
+ CAD (Collision Gas Pressure): Kiểm soát áp suất khí N2 trong bộ tứ cực Q2, thúc đẩy quá trình phân mảnh thứ cấp, ngoài ra còn có tác dụng làm mát các ion con và hƣớng chúng đến bộ tứ cực Q3.
Tự động khảo sát các thông số cho từng chất trên với các giá trị nhƣ sau:
IS chế đô ̣ ion dƣơng (V):5000,0; 4500,0; 4000,0; 3500,0
GS1 (psi): 25,0; 30,0; 10,0;15,0 GS2 (psi): 8,0; 9,0; 10,0; 5,0; 2,0; CUR (psi): 15,0;20,0; 5,0; 10,0; DP (V) :110,0; 120,0; 100,0; 90,0; 80,0 EP (V) : 0;7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0 CAD (psi): 7,0; 8,0; 9,0; 5,0; 6,0
Qua khảo sát ta thu đƣợc giá trị tối ƣu của từng thông số trên cho cả các chất nghiên cứu. Giá trị đƣợc liệt kê trong bảng 2
Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu MS/MS đối với chế đô ̣ ion dƣơng
Thông số Gía trị tối ƣu
IS (V) 4500 TEM (oC) 500 GS1 (psi) 25 GS2 (psi) 20 CUR (psi) 20 DP (V) 130 EP (V) 9 CAD (psi) 7
Kết luận: Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện MS và đƣa ra đƣợc các điều kiện tối ƣu nhƣ trong bảng trên.
3.1.2. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
3.1.2.1. Lựa chọn cột tách
Cột tách là bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký, nó đóng góp một phần
quan trọng trong việc quyết định quá trình tách.Qua tham khảo các bài báo nên