Thời gian lên men vi sinh vật phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Trung bình thời gian lên men của mỗi mẻ sản xuất acid lactic trong công nghiệp từ 2 đến 6 ngày [2], [14], [18], [19], [38], [42], tùy thuộc vào loại VSV sử dụng, loại B. coagulans chỉ khoảng 11 đến 19 giờ [54] và cũng tùy thuộc vào mục đích thu sản phẩm dạng L hay dạng D, chủng L. acidophilus nuôi cấy 48 giờ sinh 68% acid L lactic [41], 13,5 giờ sinh 91% dang acid L lactic [31]. Sau khi đã lựa chọn các điều kiện lên men khác nhƣ: chủng vi sinh vật, loại đƣờng, nồng độ đƣờng, thời điểm bổ sung chất đệm, thì thời gian lên men là yếu tố đƣợc lựa chọn cuối cùng. Thời điểm tốt nhất thu sản phẩm là thời điểm ngắn nhất sao cho hiệu suất tiêu thụ đƣờng cao nhất. Nếu chọn thời đểm 72 giờ thì hiệu suất chỉ đạt gần 50% (46,6%) kém thời điểm 96 giờ (72,5%) là khoảng 22%, chọn thời điểm 120 giờ hiệu suất (77,7%) chỉ hơn thời điểm 96 giờ là 5%, trong khi đó nếu kéo dài thời gian lên men sẽ tăng khả năng nhiễm trùng, tốn năng lƣợng duy trì các điều kiện lên men và nhân công. Vì vậy, cân bằng những ƣu điểm và nhƣợc điểm, thông thƣờng nghiên cứu sẽ chọn thời điểm 96 giờ để làm thời điểm kết thúc quá trình lên men.
Tuy nhiên, khi nghiên cứu về điều kiện phản ứng tổng hợp thông thƣờng [74], phản ứng của acid lactic với nồng độ 22,0-33,3% trong cồn, ở nhiệt độ 70 ° C, thêm từ từ MgO cho đến khi pH trong khoảng 6,5-7,2 tỷ lệ mol phản ứng là 1: (0,05-0,08), thời gian phản ứng khoảng 2,5 giờ đến 3,0 giờ. Nhƣ vậy, áp dụng vào điều kiện phản ứng lên men, sau 72 giờ ngừng lên
68
men. Sau đó, xử lý dịch lên men theo điều kiện của phản ứng hóa học. Nghĩa là, bổ sung MgCO3 đến pH = 7,0 và đun diệt tế bào thêm 2,5 đến 3 giờ ở nhiệt độ 70o
C và làm cho phản ứng tạo sản phẩm Magnesi lactat xảy ra hoàn toàn.
4.4. B n luận về phƣơng pháp tinh hế
4.4.1. Về phương pháp kết tinh
Muối Magnesi lactat tan trung bình ở trong nƣớc (độ tan 4g/100ml trong nƣớc lạnh), độ tan kém hơn Calci lactat (độ tan 7,9g/100ml nƣớc ở 300oC) [6], [35]. Trong cùng 100 ml dịch lên men, cùng chủng giống
L.acidophilus nồng độ đƣờng 7% (kl/tt), muối Calci chỉ cần cô còn ½ thể tích, tự kết tinh ở nhiệt độ 4 – 10oC [6], trong khi đối với muối Magnesi lactat, thực hiện theo đúng quy trình sản xuất muối Calci thì không thu đƣợc một chút sản phẩm nào phải thực hiện cô cạn hơn (cô còn 30% thể tích 2,49 g sản phẩm; cô còn 1/10 thể tích đạt 4,43 g sản phẩm) hoặc tạo mầm tinh thể (6,3 g đến 6,5 g sản phẩm). Phù hợp với nghiên cứu [18], cô dịch chứa 5,5% Magnesi lactat còn 15% thể tích hay nghiên cứu khác cô còn 1/3 thể tích [74]. Điều này có thể giải thích là do quá trình kết tinh bị chi phối bởi cả hai yếu tố nhiệt động lực và động lực phân tử, trạng thái quá bão hòa trong dung dịch là chƣa đủ điều kiện để mầm tinh thể hình thành, phải vƣợt qua năng lƣợng tự do phụ thuộc bản thân phân tử muối và dung môi [55], [63] nhƣ vậy trong cùng điều kiện và dung môi, năng lƣợng tự do của muối Magnesi lactat lớn hơn nhiều so với muối Calci, hơn nữa, quá trình tạo mầm bắt đầu từ những cụm ổn định tạo thành hạt nhân, hạt nhân tạo ra đạt kích thƣớc tới hạn, mầm sẽ lớn lên để giảm năng lƣợng tự do, khi các cụm không ổn định, nó sẽ bị tái hòa tan trở lại vào dung dịch, với năng lƣợng tự do lớn, các cụm muối Magnesi kém ổn định và dễ bị hòa tan trở lại trƣớc khi đạt đƣợc kích thƣớc tới hạn của mầm, do đó tinh thể muối Magnesi khá nhỏ và mảnh, khác với muối Calci to và thô, vậy nên quá trình tạo mầm tinh thể của Magnesi lactat không thể xảy ra ở cùng nồng độ với muối Calci, mà phải cung cấp thêm năng
69
lƣợng cho quá trình này bằng cách gãi kết tinh hoặc thả mầm tinh thể đƣợc tạo sẵn vào hoặc nồng độ phải thật đậm đặc.
Thực nghiệm và các nghiên cứu cho thấy, đối với tinh thể muối Magnesi lactat, quá trình kết tinh đã là một bƣớc lọc hiệu quả [19], [54], [37]. Thí nghiệm ở bình (4) gãi kết tinh từ 2 – 5 phút, tinh thể kết tinh ồ ạt và độ tinh khiết vẫn đạt trên 95%, cao hơn phƣơng pháp tạo một vài mầm kết tinh (3) (91% đến 95%). Bên cạnh đó, hình dạng tinh thể nhỏ, mịn sẽ thuận lợi hơn ứng dụng làm tá dƣợc hay dƣợc chất trong bào chế.
4.4.2. Về nhiệt độ kết tinh
Độ tan của Magnesi lactat thay đổi theo nhiệt độ (1g/25 ml nƣớc lạnh và 1g/3,5ml nƣớc nóng [35], khoảng 1g/16ml nƣớc nhiệt độ thƣờng [74]), nhiệt độ thấp tạo điều kiện cho quá trình kết tinh xảy ra hoàn toàn, do đó lƣợng sản phẩm thu đƣợc thấp hơn khi kết tinh ở nhiệt độ 370
C (5 g), tuy nhiên hiệu suất thu sản phẩm ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh khác biệt không đáng kể (6,49 và 6,57 g tƣơng ứng), lại tiết kiệm đƣợc năng lƣợng, thiết bị nên nghiên cứu chọn nhiệt độ kết tinh là phòng 25 – 300C. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Peter Johannes Marie Baets [54], Magnesi lactat có thể kết tinh ở cả hai điều kiện làm lạnh và không làm lạnh, tuy nhiên nó thƣờng đƣợc kết tinh trong khoảng nhiệt độ từ 20 – 950C, đặc biệt là từ 50 – 900C với nguồn hydratcacbon thô, nhiều tạp, vì ở nhiệt độ cao, các tạp sẽ nằm lại trong pha lỏng, tránh đồng kết tinh với nhu và đồng kết tinh với Magnesi lactat [54].
4.4.3. Về thời gian kết tinh
Thời gian kết tinh thƣờng ảnh hƣởng đến quá trình kết tinh của tinh thể. Hầu hết các nghiên cứu đều để qua đêm hoặc sau 24 giờ mới thu tinh thể [19] song kết quả thực nghiệm của nghiên cứu cho thấy, chỉ cần ít nhất 6 giờ với phƣơng pháp gãi kết tinh 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, lƣợng Magnesi lactat thu đƣợc đã đạt mức tối đa (5,59 g), có tăng thêm thời gian kết tinh thì lƣợng
70
sản phẩm thu đƣợc cũng thay đổi không đáng kể (6,45 g), do đó nghiên cứu chọn thời gian kết tinh Magnesi lactat là 6 giờ với lƣợng sản phẩm thu đƣợc là 6,2 g.
4.5. Về định tính, á định ấu trú v kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi la tat sinh tổng hợp
4.5.1.Về định tính
Khi nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 trong môi trƣờng MRS có bổ sung MgCO3 có thể thu đƣợc Magnesi lactat. Sản phẩm sau khi tinh chế là tinh thể có màu trắng, hình kim (ảnh tinh thể -
hình 4.1), kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gerrit Leendert Nanninga (2005) đã công bố [37], Magnesi lactat có thể dễ dàng thu đƣợc từ quá trình lên men của carbohydrat thành acid lactic. Magie lactat kết tinh từ nƣớc lên men thành tinh thể khối hình thuôn dài [19].
Kết quả định tính Magnesi lactat thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng [3] cho thấy vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử tƣơng ứng về vị trí, màu sắc và giá trị Rf với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (Rf
= 0,67).
Hình 4.1. Hình ảnh tinh thể Magnesi lactat chụp qua kính hiển vi
71
4.5.2. Về cấu trúc của sản phẩm Magnesi lactat sinh tổng hợp
Trên phổ hồng ngoại quan sát thấy dải hấp thụ đặc trƣng của nhóm COO- tại 1610 (C=O), 1184 và 1128cm-1 (C–O). Phổ khối lƣợng cho pic phân tử m/z ở 200,9 phù hợp với công thức phân tử của Magnesi lactat C6H10MgO6
(với m = 202). Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton cho tín hiệu đặc trƣng của mảnh lactat: tín hiệu Doublet của 3 hydro nhóm –CH3 (δ=1,28 ppm), và tín hiệu quartet của 1 hydro nhóm –CH– (δ=4,09 ppm). Hằng số tƣơng tác spin – spin của các hydro này giống nhau (J = 7,0 Hz).
Kết quả xác định số phân tử nƣớc trong sản phẩm cho thấy cấu trúc sản phẩm chứa 2 phân tử nƣớc.
Từ các phân tích trên có thể khẳng định sản phẩm thu đƣợc là Magnesi lactat dihydrat có công thức cấu tạo nhƣ sau:
4.5.3. Về kiểm nghiệm
Kết quả kiểm nghiệm cho thấy sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lƣợng dƣợc điển Anh (BP 2010) [22]. Trong quá trình lên men và sau tinh chế hầu nhƣ không có các tạp hữu cơ khác nhƣ acid lactic, acid acetic, acid formic, ethanol - những sản phẩm phụ của quá trình lên men, điều này chứng tỏ chủng Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 lên men trong điều kiện thí nghiệm và phƣơng pháp tinh chế áp dụng cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic, đã kết hợp với Magnesi carbonat có trong môi trƣờng nuôi cấy để tạo thành Magnesi lactat.
Phù hợp với nghiên cứu của Gerrit Leendert Nanninga (2005), Magie lactat thu đƣợc rất tinh khiết. Do đó bất kỳ nguồn carbohydrat có thể đƣợc sử dụng, thậm chí nguồn carbohydrat tƣơng đối thô, ví dụ sucrose, tinh bột (lỏng), rỉ đƣờng [37], hay nghiên cứu của Bode Harold Eli và các cộng sự
72
(1969) đã đƣa ra quy trình tinh chế Magie lactat từ một hỗn hợp chiết acid lactic thô với rỉ đƣờng, sữa và các loại rƣợu, thu tinh thể Magie lactat có độ tinh khiết cao [19]. Nghiên cứu có thể áp dụng để tận dụng nguồn phế phẩm để sản xuất một nguyên liệu giá rẻ dùng trong công nghiệp và Y tế.
73
ẾT LUẬN VÀ IẾN NG Ị
Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài, nghiên cứu đã đạt đƣợc một số kết quả sau:
1. Đã lựa chọn một số điều kiện của quá trình nuôi cấy Lactobacillus acidophilus sinh tổng hợp Magnesi lactat quy mô phòng thí nghiệm để nâng cao hiệu suất đạt 72%.
Đã xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính giữa độ OD600 và mật độ tế bào với hệ số tƣơng quan R2
= 0,98.
Đã khảo sát ảnh hƣởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L. acidophilus: nồng độ ionMg2+ từ 0,5% đến 2,0% không có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật và còn làm tăng khả năng sinh acid lactic của vi sinh vật nghiên cứu.
Đã lựa chọn đƣợc phƣơng thức bổ sung dần Magnesi cacbonat sau mỗi 24 giờ để môi trƣờng nuôi cấy duy trì pH = 6,0.
Đã lựa chọn nguồn hydrat carbon thích hợp là glucose với nồng độ 9%, và thời điểm thu sản phẩm là 72 giờ.
2. Đã lựa chọn phƣơng pháp và điều kiện của quá trình kết tinh: cô dịch kết tinh còn 30ml và gãi kết tinh 2 – 5 phút đến khi tạo hỗn dịch đặc, nhiệt độ kết tinh thƣờng 25 – 30oC và thời gian kết tinh là 6 giờ.
3. Đã xác định cấu trúc và kiểm nghiệm Magnesi lactat theo tiêu chuẩn Dƣợc Điển Anh 2010.
Bằng phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phân tử (MS), cộng hƣởng từ proton (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nƣớc đã chứng minh hợp chất nghiên cứu có cấu tạo phù hợp công thức muối Magnesi lactat dihydrat.
74
Kiểm nghiệm sản phảm Magnesi lactat đạt các chỉ tiêu theo tiêu chuẩn Dƣợc Điển Anh 2010 về: định tính ion Mg2+, định tính ion lactat, định lƣợng sản phẩm Magnesi lactat đạt 98,25%.
Kiến nghị
Để đề tài có tính ứng dụng trong thực tế, chúng tôi xin đƣa ra một số đề xuất nhƣ sau:
- Tiếp tục nghiên cứu quá trình lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat bằng các chủng vi khuẩn hay sử dụng trong công nghiệp khác để nâng cao hiệu suất nhƣ Lactobacillus delbrueckii.
- Mở rộng nghiên cứu về việc sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền hơn (phụ phẩm của các ngành công nghiệp khác, nhƣ rỉ đƣờng, cám gạo…) để phục vụ nâng cấp quy trình sinh tổng hợp Magie lactate lên quy mô lớn, ứng dụng vào sản xuất công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1.Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, tr.40 – 50, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
2.Ngô Lâm Tuấn Anh (2010), Công nghệ sản xuất acid lactic, tr.41 –
54, Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật thành phố Hồ Chí Minh.
3.Bộ Y Tế (2012), Dược điển Việt Nam IV, tr.375.
4.Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, tr.27-99, 296-346, Nhà xuất bản Giáo Dục.
5.Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Tý, Dƣơng Văn Hợp, Nguyễn Liên Hoa, Định Thúy Hằng, Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Hoài Hà, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Nguyễn Văn Bắc, Hoàng Văn Vinh (2012), Vi sinh vật học phần I, tr. 134 – 137, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
6.Kiều Thị Hồng (1999), Tối ưu hóa quá trình lên men sinh tổng hợp Calci lactat, Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, tr. 1 - 15.
7.Nguyễn Văn Thanh (2010), Công Nghệ sinh học Dược, tr. 100 – 110, Nhà xuất bản Giáo dục.
8.Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân (2013), Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm, tr. 42-54, Nhà xuất bản Y Học.
9.Nguyễn Đức Lƣợng, (1996), Công nghệ vi sinh vật tập 3, Thực phẩm lên men truyền thống, Trƣờng đại học kỹ thuật TP HCM, tr. 67 - 69.
10. Nguyễn Đình Triệu (2005), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, tập II, tr. 145 – 170, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
Tiếng Anh
11. Abrams S. A., Chen Z., and Hawthorne K. M. (2014), “Magnesium metabolism in 4-year-old to 8-year-old children”, J Bone Miner Res. 29(1), p. 118-122.
12. Afsar B. and Elsurer R. (2014), “The relationship between magnesium and ambulatory blood pressure, augmentation index, pulse wave velocity, total peripheral resistance, and cardiac output in essential hypertensive patients”, J Am Soc Hypertens. 8(1), p. 28-35.
13. Agustin, Van Breugel, Willem Jacob, Peter Paul (2013), “Patent Purac biochem", Patent WO2013/117687, p. 1,2.
14. Aharon Meir Eyal, Rod Fisher (1998), “A process for the recovery of lactic acid”, Patent WO 1998037050, p. 1-10.
15. Atlan D., Regis H. and Gastaut H. (1967), “Treatment of spasmophilia in the adult by magnesium lactate”, Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 23(4), p. 388.
16. Baker W. L., et al. (2009), “Effect of magnesium L-lactate on blood pressure in patients with an implantable cardioverter defibrillator”, Ann Pharmacother. 43(4), p. 569-576.
17. Bautista Gallego, Arroyo-López, Durán-Quintana, Garrido- Fernandez, (2008), “Individual effects of sodium, potassium, Calcium, and magnesium chloride salts on Lactobacillus pentosus and Saccharomyces cerevisiae growth”, Food Prot, 71(7), p.1412-21.
18. Ben-Yoseph Eliahu, Kogan Leni, Wajc Samuel, (1999), “Process for preparing lactic acid”, Patent WO 2000017378 A3, p.1-7.
19. Bode Harold Eli (1969), “High purity magnesium lactate from steepwater”, Patent US3429777, p.2.
20. Bøhmer T., Røseth A., Holm H., Weberg-Teigen L., Wahl L., (1990), “Bioavailability of oral magnesium supplementation in female
students evaluated from elimination of magnesium in 24-hour urine”,
Magnesium Trace Element p. 9, 272-278.
21. Breed RS, Dotterrer WD (1916), “The Number of Colonies Allowable on Satisfactory Agar Plates”, Journal of Bacteriology 1(3), p. 321–331.
22. British Pharmacopoeia Commission (BPC) (2010), Bristish Pharmacopedia, p. 1325.
23. Cheng Zhen, Gong Weitao, Lin Yuan, Ning Guiling, Pang Hongchang, (2013), “Materials Research Bulletin” 48(3), p. 1333 - 1337.
24. Coudray C, Rayssiguier Y. (2001), “Impact of vegetable products on intake, intestinal absorption and status of magnesium”, Advances in magnesium research: nutrition and health. London, p. 115-123.
25. Council of Europe European (COE) - European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM) (2005), Sodium (S)-lactat solution, European pharmacopoeia 5.0, 2438-2439.
26. Dumont (1965), “Treatment of uterine pain in pregnancy with magnesium lactate”, Lyon Med. 213(21), p. 1571-1582.
27. Fagerbakke, K. M., Norland, S., and Heldal, M. (1999), “The inorganic ion content of native aquatic bacteria”, Can J Microbiol. 45(4), p. 304-311.
28. FAO/ WHO (1989), Report of the 15th session of the codex committee on food additives, the United Nations.
29. Firoz M, Graber M. (2001), “Bioavailability of US commercial magnesium preparations”, Magnes Res, p. 14:257-262.
30. Friedrich Widdel (2010), “Theory and Measurement of Bacterial Growth”, Grundpraktikum Mikrobiologie, 4. Sem. (B.Sc.), Universität Bremen, p. 4-11.
31. Garvie Ellen (1967), “Production of L(+) lactic acid and D(-) lactic acid in cultrures of some lactic acid and bacteria with a special study of
Lactobacillus acidophilus NCDO2”, J.Dairy Res, p. 34, 31.
32. Gomes A.M.P., Malcata F.X. (1999), “Bifidobacterium spp. and
Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics”, Trends Food Sci. Technol. 10, p. 139-157.
33. Hatice yavuzdurmaz (2007), Isolation, characterization, determination of probiotic properties of lactic acid bacteria from human milk, Master of science in Food Engineering, p.1 - 40.
34. Heldal M., et al. (2012), “Mg2+ as an indicator of nutritional status in marine bacteria”, ISME J. 6(3), p. 524-530.
35. Index Merck (2001), 13th Edition, , Merck & Co, Whitehouse