Nuôi cấy L. acidophilus trong môi trƣờng MRS có bổ sung 2,6% sữa với pH thay đổi từ 3,5 đến 8,0 (Chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy bằng dung dịch HCl 3N). Sau thời gian 24 giờ xác định mật độ tế bào vi sinh vật qua giá trị độ đục OD600 của dịch nuôi cấy ở bƣớc sóng 600nm theo phƣơng pháp mô tả mục 2.3.3.2. Kết quả biến thiên mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi cấy sau 24 giờ (thể hiện ở OD600 của dịch nuôi cấy) theo pH của dịch lên men đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Biến thiên mật độ vi sinh vật (OD600) theo pH của môi trƣờng nuôi cấy
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy giá trị OD600 sau 24 giờ nuôi cấy tại các môi trƣờng có pH từ 5,5 đến 8,0 cao hơn các môi trƣờng có pH từ 3,5 đến 5,0. Do mật độ vi sinh vật tỷ lệ thuận với mật độ quang OD600 trong một khoảng độ pha loãng vi sinh vật phù hợp [30] nên có thể sơ bộ kết luận rằng vi sinh vật
40
phát triển tốt tại các khoảng pH từ 5,5 đến 8,0 trong đó OD600 đạt giá trị cao nhất tại pH = 6,0. Vì vậy giá trị pH = 6,0 đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4. Lựa chọn cách bổ sung Magnesi carbonat vào môi trường nuôi cấy L. acidophilus
Nuôi cấy L. acidophilus ATCC 4356 trong môi trƣờng MRS có 2,6% sữa bột, bổ sung MgCO3 vào môi trƣờng nuôi cấy L. acidophilus theo một trong hai phƣơng pháp sau:
1) Thêm MgCO3 vào môi trƣờng nuôi cấy ngay thời điểm ban đầu.
2) Bổ sung dần MgCO3 để duy trì pH 6,0 vào các thời điểm sau mỗi 24 giờ. Lƣợng MgCO3 thêm vào môi trƣờng nuôi cấy ngay thời điểm ban đầu ở phƣơng pháp 1 là 2,0g tƣơng đƣơng với tổng lƣợng MgCO3 bổ sung dần trong phƣơng pháp 2.
Sau thời gian 96 giờ thu sản phẩm theo phƣơng pháp mô tả mục 2.3.2. Tính tổng lƣợng MgCO3 sử dụng, hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat thô theo phƣơng pháp mô tả mục 2.3.4., hàm lƣợng Magnesi lactat trong sản phẩm thô theo phƣơng pháp mô tả mục 2.3.6.3. Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau. Xử lý số liệu theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.3.9. Kết quả tổng lƣợng Magnesi carbonat bổ sung, hàm lƣợng Magnesi lactat tạo thành và hiệu suất quá trình đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.3. So sánh hai phương phápbổ sung MgCO3 vào môi trường nuôi cấy.
Thí nghiệm Thông số
Cách bổ sung MgCO3 Thời điểm an đầu Sau mỗi 24 giờ
Lƣợng MgCO3 sử dụng (g) 2,0 ± 0,2 2,2 ± 0,3
Hiệu suất (%) 22,1 ± 1,6 67,9 ± 2,6
41
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy khi lƣợng MgCO3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy lúc ban đầu tƣơng đƣơng với tổng lƣợng MgCO3 đã bổ sung dần dần (khoảng 2g), sau 96 giờ hàm lƣợng Magnesi lactat trong sản phẩm thô của hai phƣơng pháp đều đạt trên 90%. Tuy nhiên hiệu suất tạo Magnesi lactat trong phƣơng pháp bổ sung dần dần MgCO3 lớn hơn hiệu suất của phƣơng pháp cho MgCO3 vào môi trƣờng nuôi cấy ngay từ đầu, kết quả khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05).
Do vậy, nuôi cấy vi sinh vật với cách thức bổ sung dần MgCO3 đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH duy trì môi trường nuôi cấy đến hiệu suất thu sản phẩm.
Theo kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.3 thì pH 6,0 là pH thích hợp để chủng vi sinh vật nghiên cứu tăng sinh khối của mình. Tuy nhiên, để tạo ra nhiều sản phẩm Magnesi lactat thì vi sinh vật phải tạo đƣợc nhiều acid lactic. Mặc khác theo một số nghiên cứu đã công bố, môi trƣờng lên men duy trì pH 5,0 đến 7,0 cần bổ sung các chất đệm phù hợp để sản xuất Magnesi lactat với hiệu suất cao với nhiều loại vi sinh vật khác nhau [14], [18], [38]. Do đó, nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu khảo sát khả năng tạo sản phẩm Magnesi lactat của chủng vi sinh vật nghiên cứu ở khoảng pH từ 5,0; 6,0; 7,0 theo phƣơng pháp đã lựa chọn từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.4. Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau. Kết quả tổng lƣợng Magnesi carbonat bổ sung, khối lƣợng Magnesi lactat tạo thành và hiệu suất quá trình đƣợc trình bày trong bảng sau:
42
Bảng 3.4. Hiệu suất thu Magnesi lactat khi nuôi cấy L. acidophilus ở các pH khác nhau
pH duy trì
Thông số pH 5 pH 6 pH 7 p
Hiệu suất trung bình (%) 55,47 ± 9,6 72,56 ± 6,3 50,53 ± 6,3 0,027 Tổng lƣợng MgCO3 bổ
sung (g) 2,52 ± 0,34 3,19 ± 0,33 3,69 ± 0,23 0,01
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hiệu suất tạo Magnesi lactat ở các pH duy
trì môi trƣờng nuôi cấy khác nhau
Các kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, tại các pH từ 5,0 đến 7,0 lƣợng sản phẩm Magnesi lactat thu đƣợc khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,027), trong đó lƣợng sản phẩm ở pH 6,0 cho kết quả cao nhất 72,56 ± 6,3%. Lƣợng sản phẩm tạo thành giảm khi pH 5,0 (55,47 ± 9,6 %) và 7,0 (50,53 ± 6,3).
Trong khi đó lƣợng Magnesi carbonat bổ sung nhiều nhất ở pH = 7,0 là 3,69 ± 0,23 g và khác có ý nghĩa thống kê so với các môi trƣờng pH 5 và 6 (p = 0,01). Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Aharon khi nuôi cấy
L. acidophilus để thu Magnesi lactat bằng cách duy trì pH trong khoảng 6,0 bằng Magnesi cacbonat [14]. Từ đó có thể lựa chọn duy trì pH môi trƣờng
43
nuôi cấy là 6,0 cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao hiệu suất thu sản phẩm.
3.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn hydratcacbon tới hiệu suất thu sản phẩm.
L. acidophilus thuộc có khả năng chuyển hóa hydratcarbon: fructose, galactose, glucose, lactose, maltose, mannose, sucrose và trehalose cho sản phẩm là L(+) Lactic [5], [32], [41]. Nhằm lựa chọn ra loại hydratcarbon phù hợp có sẵn trong tự nhiên, giá rẻ và cho hiệu suất thu sản phẩm Magnesi lactat cao, nghiên cứu đã khảo sát ảnh hƣởng của 4 loại đƣờng khác nhau: glucose, saccarose, maltose, lactose. Lên men theo phƣơng pháp đã lựa chọn từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.5 (bổ sung MgCO3 dần, duy trì pH môi trƣờng lên men 6,0). Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau. Kết quả tổng lƣợng Magnesi carbonat bổ sung, khối lƣợng Magnesi lactat tạo thành và hiệu suất quá trình đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.5. Hiệu suất tạo Magnesi lactat khi lên men với các loại hydratcacbon khác nhau
Hydratcarbon Thông số
Glucose Saccarose Lactose Maltose p
Hiệu suất trung bình (%) 90,56 ± 3,03 68,2 ± 6,40 63,48 ± 0,90 61,06 ± 4,86 0,006 Tổng lƣợng MgCO3 (g) 1,74 ± 0,36 2,22 ± 0,49 1,99 ± 0,01 1,73 ± 0,02 0,435 OD600 ban đầu 0,052 ± 0,002 OD600 kết thúc (pha loãng 10 lần) 0,512± 0,02 0,206±0,02 0,243±0,01 0,221± 0,03 0,032
44
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh Magnesi lactat khi sử dụng các nguồn hydratcacbon khác nhau
Từ bảng và hình trên nhận thấy thấy, trong 4 nguồn hydratcacbon sử dụng, L.acidophilus đồng hóa glucose cao nhất, hiệu suất sinh Magnesi lactat lên tới 90,56 ± 3,03 % và thấp dần ở các loại đƣờng saccarose, lactose và maltose, kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,006).
Trong khi đó, lƣợng Magnesi carbonat bổ sung để duy trì pH = 6,0 của các loại đƣờng sử dụng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p = 0,435). Kết thúc quá trình nuôi cấy, các giá trị OD600 đều tăng và sự khác nhau giữa các giá trị này trong các loại đƣờng khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,032). Nói cách khác, sinh khối và khả năng tiêu thụ MgCO3 của các loại đƣờng trên là khác nhau. Trong đó, nhóm khác biệt so với 3 nhóm còn lại đó là đƣờng glucose OD600 = 0,512 ± 0,02. Nhƣ vậy, đƣờng glucose vừa cho sinh khối nhiều nhất, vừa sinh acid lactic và sản phẩm nhiều nhất.
45
Nhƣ vậy, lên men L.acidophilus sử dụng nguồn hydratcacbon là glucose cho hiệu suất sinh Magnesi lactat cao nhất, lựa chọn glucose là nguồn hydratcacbon cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất thu sản phẩm
Trong công nghiệp, có thể sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu chứa glucose với các nồng độ khác nhau. Để tiết kiệm chi phí, có thể cô đặc hoặc pha loãng để có nồng độ đƣờng phù hợp sao cho hiệu suất lên men thu sản phẩm là cao nhất. Vì vậy nghiên cứu đã tiến hành khảo sát nồng độ đƣờng glucose với các nồng độ khác nhau: 2%; 5%; 7%; 9%; 11%; Lên men theo phƣơng pháp đã lựa chọn từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.6. Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau. Kết quả tổng lƣợng Magnesi carbonat bổ sung và hiệu suất quá trình đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.6. Kết quả hiệu suất Magnesi lactat khi lên men với các nồng độ glucose khác nhau
Nồng độ glucose
Thông số 2 % 5 % 7 % 9 % 11 % p
Hiệu suất trung bình(%) 90,56 ±3,03 56,56 ±10,26 62,26 ±11,47 72,14 ±7,54 47,5 ±11,33 0,004 Tổng lƣợng MgCO3 bổ sung (g) 1,74 ±0,36 3,63 ±0,90 4,01 ± 0,35 4,96 ±0,5 4,65 ±0,45 0,001 Khối lƣợng sản phẩm (g) 2,95 ±0,28 3,50 ±1,25 5,25 ±0,49 8,02 ±1,06 6,91 ±1,65 0,016
46
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh hiệu suất tạo Magnesi lactat ở các nồng độ glucose khác nhau
Từ bảng 3.6 và hình 3.6 nhận thấy, khi lên men L. acidophilus trong môi trƣờng với nồng độ glucose tăng dần từ 2% đến 9% thì lƣợng sản phẩm thu đƣợc tăng dần (2,95 g ở 2% glucose và 8,05 g ở 9% glucose) nhƣng khi nồng độ glucose 11% thì khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc không những không tăng mà còn giảm 6,91 g.
Kết quả tính toán cho thấy hiệu suất tiêu thụ đƣờng của L. acidophilus
trong môi trƣờng với nồng độ glucose 2% cho hiệu suất 90,56 ± 3,03 %. Còn môi trƣờng lên men sử dụng nồng độ glucose từ 5% đến 9%, sau 96 giờ lên men, hiệu suất tạo sản phẩm tăng dần theo nồng độ glucose, cao nhất ở 9% với hiệu suất 72,14 ± 7,54 %, hiệu suất giảm dƣới 50% khi tăng nồng độ lên tới 11% glucose. Kết quả khác biệt có có ý nghĩa thống kê (p = 0,004).
Lƣợng Magnesi carbonat bổ sung cũng tƣơng ứng với hiệu suất tạo sản phẩm với các môi trƣờng sử dụng nồng độ đƣờng khác nhau, ngoại trừ nồng
47
độ đƣờng 2% thì hiệu suất thu sản phẩm cao, nhƣng lƣợng Magnesi carbonat sử dụng lại thấp nhất 1,74 ±0,36g.
Nhƣ vậy, lựa chọn nồng độ đƣờng 9% phù hợp nhất sử dụng để thu đƣợc sản phẩm Magnesi lactat áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.8. Lựa chọn thời điểm thu sản phẩm
Trong công nghiệp, khi thời gian lên men đƣợc rút ngắn, thì sẽ giảm đƣợc nguy cơ nhiễm trùng và tiết kiệm đƣợc các chi phí nhƣ nhân công, năng lƣợng, hao mòn máy móc… Do đó nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men tới hiệu suất thu sản phẩm. Lên men 4 bình theo phƣơng pháp đã lựa chọn từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.7 (phƣơng pháp bổ sung dần MgCO3, duy trì pH môi trƣờng lên men 6,0, với nồng độ glucose 9% ), nhƣng thời điểm thu sản phẩm lần lƣợt là 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Kết quả tổng lƣợng Magnesi carbonat bổ sung và hiệu suất quá trình đƣợc trình bày trong bảng và hình sau:
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát lượng sản phẩm Magnesi lactat thu được theo thời gian Thời gian lên men (giờ) Thông số 24 48 72 96 120 p Khối lƣợng MgCO3 (mg) 0,8± 0,012 1,1± 0,042 1,2± 0,064 1,3± 0,091 0,4± 0,032 0,012 Nồng độ acid lactic (%) 1,4± 0,018 1,7± 0,023 2,0± 0,078 0,5± 0,034 0,0 0,021 Hiệu suất (%) 12,2± 11,32 28,2± 7,54 46,6± 10,43 72,5± 8,54 77,7± 5,65 0,034
48
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn các thông số theo thời gian lên men
Từ bảng 3.7 và hình 3.7 nhận thấy, với nồng độ đƣờng glucose sử dụng là 9%, từ thời điểm 72 giờ trở đi lƣợng acid lactic sinh ra bắt đầu giảm mạnh từ 2,0% xuống còn 0,5%, và đến 120 giờ thì VSV không sinh acid lactic nữa. Hiệu suất ở thời điểm 72 giờ là gần 50%.
Tuy nhiên, khi tiếp tục lên men và bổ sung thêm MgCO3 thì hiệu suất thu sản phẩm vẫn tăng sau 72 giờ và đạt hiệu suất tối đa vào thời điểm 120 giờ là khoảng 77,7%. Nhƣ vậy từ giờ thứ 96 giờ đến 120 giờ thì hiệu suất chỉ tăng lên khoảng 5%. Sau thời điểm 72 giờ, acid lactic sinh ra đã giảm mạnh, nhƣng lƣợng MgCO3 bổ sung vẫn tăng đến 96 giờ, vì phản ứng hóa học giữa acid lactic và magnesi carbonat vẫn đang xảy ra và kéo dài thời gian so với phản ứng tổng hợp thông thƣờng [74]. Bảng sau so sánh sự giống và khác nhau giữa phản ứng hóa học và phản ứng trong điều kiện lên men.
49
Bảng 3.8. So sánh các điều kiện của phản ng hóa học và phản ng trong điều kiện lên men tạo sản phẩm Magnesi lactat
L ên me n Thí nghiệm Thông số TN1 TN2 TN2 TN4 TN5
Nhiệt độ lên men 37oC
Thời gian lên men 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
Nồng độ A.lactic (%) 1,4 1,7 2,0 0,5 0,0 Kl MgCO3 (mg) 0,8 1,1 1,2 1,3 0,4 Tỷ lệ mol 1:0,65 1:0,69 1:0,67 1:3,07 0:0,004 pH duy trì 6 Kl sản phẩm (mg) 1,33 1,73 1,99 2,16 0,65 T ổn g h ợp h ó a h ọc [74 ] Nhiệt độ phản ứng 70 oC Thời gian phản ứng 3h 2,5h 3h Nồng độ A.lactic (%) 22,0 27,8 33,3 Kl MgO (mg) 8,0 6,1 8,2 Tỷ lệ mol axit lactic:MgO 1:0,83 1:0,50 1:0,56 pH duy trì 7,2 6,5 7,0 Kl sản phẩm (mg) 44,6 33,9 45,4
Từ bảng trên, nhận thấy trong thời gian đầu lên men 24 giờ – 48 giờ, tỷ lệ mol acid lactic: MgCO3 là 1:0,6 tƣơng tự tỷ lệ mol của acid lactic: MgO của phản ứng hóa học 1: (0,05-0,08). Nhƣng phản ứng hóa học thời gian phản ứng chỉ khoảng 2,5 giờ đến 3,0 giờ. Tỷ lệ mol của MgO phản ứng hóa học tăng, thì pH duy trì của phản ứng hóa học cũng tăng từ 6,5 đến 7,2 thì khối lƣợng sản phẩm Magnesi lactat so với nồng độ acid lactic cũng tăng.
Trong khi đó, phản ứng trong điều kiện lên men pH duy trì chỉ là 6,0 nên sau 96 giờ một phần lƣợng acid lactic vẫn dƣ, một phần vi sinh vật vẫn có
50
khả năng tạo ra một lƣợng acid nhỏ nữa. Nhƣ vậy, nếu sau 72 giờ ngừng lên men. Sau đó, xử lý dịch lên men theo điều kiện của phản ứng hóa học. Nghĩa là, bổ sung MgCO3 đến pH = 7,0 và đun diệt tế bào thêm 2,5 đến 3 giờ ở nhiệt độ 70o
C và làm cho phản ứng tạo sản phẩm Magnesi lactat xảy ra hoàn toàn. So với các chi phí để duy trì điều kiện môi trƣờng lên men, nghiên cứu quyết định chọn thời điểm lên men 72 giờ làm thời điểm kết thúc quá trình lên men. Sau khi lên men 72 giờ, tiếp tục đun dịch lên men ở 70oC trong vòng 3 giờ. Phƣơng pháp này áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. hảo sát v lựa họn một số phƣơng pháp v điều kiện kết tinh thu sản phẩm Magnesi la tat
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp kết tinh
Căn cứ vào các nghiên cứu đã công bố về điều kiện kết tinh thu sản phẩm Magnesi lactat [18], [19]. [74]. Lên men 4 bình theo phƣơng pháp bổ sung dần MgCO3, duy trì pH môi trƣờng lên men 6,0, với nồng độ glucose 9%, thời gian lên men 72 giờ, sau đó thu sản phẩm theo phƣơng pháp đã mô tả ở mục 2.3.2., trong đó giai đoạn cô đặc, tạo tinh thể, ở mỗi bình thí nghiệm thay đổi một số thông số sau:
- Bình (1): Dịch lên men cô còn 1/10 thể tích, sau đó để tinh thể tự kết tinh. - Bình (2): Dịch lên men cô còn 1/3 thể tích, sau đó để tinh thể tự kết tinh. - Bình (3): Dịch lên men cô còn 1/3 thể tích, sau đó thả vài tinh thể hoặc gãi kết tinh để tạo một chút mầm tinh thể.
- Bình (4): Dịch lên men cô còn 1/3 thể tích, sau đó gãi kết tinh 2 – 5 phút tạo tinh thể cho tới khi xuất hiện một lƣợng lớn tinh thể, tạo thành hỗn dịch có thể chất khá đặc.
Thực hiện kết tinh hai lần: sau khi kết tinh lần thứ nhất, lọc thu lấy tinh thể, dịch lọc tiếp tục lặp lại quá trình kết tinh nhƣ trên. Thu tinh thể, sấy (nhiệt độ 40o
51
công thức ở mục 2.3.4. Định lƣợng sản phẩm thu đƣợc theo phƣơng pháp ở