Từ những kết quả đã khảo sát và lựa chọn, nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất nhƣ sau (hình 3.9):
55
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lí dịch lên men
MgCO3
Bổ sung sau mỗi 24h Lên men: 37oC,CO2 5%, 72giờ,
duy trì pH = 6,0, Thi thoảng lắc
MgCO3
Bổ sung giờ thứ 72 pH = 7,0
Đun nóng 70oC trong vòng 3 giờ
MT lên men 100ml: MRS + 2,6% sữa + giống L.Acidophilus 10% (107TBVSVS/ml)
Hỗn dịch lên men: sinh khối, acid lactic dƣ, sản phẩm Magnesi lactat
Hỗn dịch lên men: sinh khối, sản phẩm Magnesi lactat
Lọc nóng Burchner
Sinh khối Dịch lên men: sản phẩm Magnesi lactat
Than hoạt Than hoạt 2% Đun cách thủy 10 phút,
Lọc nóng Burchner
Dịch lên men
Cô cách thủy, nhiệt độ 80oC
Dịch lên men (còn 1/3 thể tích) Đun cách thủy 10 phút,
Lọc nóng Burchner Đun cách thủy 10 phút, Lọc nóng Burchner
Tinh thể Magnesi lactat
Sản phẩm tinh khiết => Kiểm nghiệm
Gãi kết tinh 2-5 phút thành hỗn dịch đặc, để yên 6h, 25-30oC, lọc
Dịch kết tinh
Lặp lại lần 2
56
Giai đoạn 2: tách chiết Magnesi lactat từ dịch lên men
Dịch lên men đƣợc đun cách thủy ở nhiệt độ 700C trong 3 giờ, để cho phản ứng giữa acid lactic và MgCO3 xảy ra hoàn toàn. Lọc nóng bằng phễu lọc Burchner, đƣờng kính lỗ lọc 0,45 μm , để loại tủa protein và các thành phần tạp không tan. Bổ sung 2% (kl/tt) than hoạt vào dịch lọc để tẩy màu, đun cách thủy 10 phút sau đó lọc nóng bằng phễu Buchner loại bỏ than hoạt.
Kết tinh: Cô cách thủy dịch lọc đến còn 30% thể tích. Gãi kết tinh 2 đến 5 phút đến khi thu đƣợc hỗn dịch đặc. Để yên trong 6 giờ, ở nhiệt độ thƣờng. Lọc bằng phễu lọc Burchner, đƣờng kính giấy lọc 0,45 μm , thu tinh thể, rửa 2 lần bằng nƣớc cất đã để lạnh. Dịch lọc tiếp tục cô còn 1/3 thể tích rồi lặp lại quá trình kết tinh.
Sản phẩm đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 40 - 500C trong 24 giờ, cân. Sản phẩm thu đƣợc màu trắng, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dƣợc điển Anh 2010. Hiệu suất thu đƣợc khoảng 70%.
57
3.3. Xá định ấu trú v kiểm nghiệm sản phẩm thu đƣợ
Sản phẩm thu đƣợc sau khi đã tinh chế theo phƣơng pháp đã thực hiện ở mục 3.2.4, đƣợc đem đi xác định cấu trúc theo phƣơng pháp mô tả mục 2.3.5 và kiểm nghiệm theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.3.6.
3.3.1. Định tính Magnesi lactat bằng sắc ký lớp mỏng
Nuôi cấy L. acidophilus trong môi trƣờng MRS có bổ sung 2,6% sữa. Sau 96 giờ tiến hành thu sản phẩm Magnesi lactat và tinh chế theo phƣơng pháp đã nêu ở trên. Sản phẩm sau tinh chế đƣợc định tính bằng sắc ký lớp mỏng theo chuyên luận nêu ở Duợc điển Việt Nam IV [3]. Kết quả cho thấy vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử tƣơng ứng về vị trí, màu sắc và giá trị Rf với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (Rf = 0,67).
3.3.2. Xác định cấu trúc
Kết quả phân tích cấu trúc sản phẩm Magnesi lactat thu đƣợc từ môi trƣờng nuôi cấy trên phổ IR, 1
H-NMR và MS (phụ lục 1,2,3) đƣợc thể hiện:
IR (KBr), υmax (cm-1): 1610 (C=O), 1184 và 1128 (C-O). ESI-MS, m/z: 200.90 ([M-H]-). 1H-NMR (500 MHz, D2O), δ (ppm): 1,28 (6H, 2s, 2CH3), 4,09 (2H, 2q, J = 7,0 Hz, 2 CH).
Xác định số lƣợng phân tử ngậm nƣớc. Kết quả tính phần trăm mất khối lƣợng nƣớc đạt 14%, kết quả này tƣơng ứng với cấu trúc ngậm 2 phân tử nƣớc. Nhƣ vậy, có thể khẳng định sản phẩm thu đƣợc có cấu trúc phù hợp với Magnesi lactat dihydrat.
58
3.3.4. Kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat.
Sản phẩm đƣợc kiểm tra chất lƣợng theo các tiêu chí trong chuyên luận Magnesi lactat của dƣợc điển Anh BP 2010 (phụ lục 4)
YÊU CẦU KẾT QUẢ
1- Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc gần nhƣ trắng Đúng 2- Độ tan: Tan trong nƣớc, dễ tan trong nƣớc sôi, thực tế
không tan trong Ethanol 90%
Đúng
3- Định tính: - Phản ứng của ion Lactat - Phản ứng của ion Magnesi
Đúng Đúng 4- Các phép thử của dung dịch S:
- Độ trong & màu sắc dung dịch: theo quy định - pH: 6,5 – 8,5 - Clorid: ≤ 200 ppm - Sulfat: ≤ 400 ppm - Sắt: ≤ 50 ppm - Kim loại nặng: ≤ 20 ppm Đúng Đạt (7,0) Đạt Đạt Đạt Đạt 5- Mất khối lƣợng do làm khô: Từ 14,0 – 17,0% Đạt (16,7%)
6- Định lƣợng : Hàm lƣợng Magnesi lactat (C6H10MgO6) từ 98,0 – 102,0%, tính theo chế phẩm đã làm khô
Đạt (98,25%)
59
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
Dựa vào các kết quả thu đƣợc và một số nghiên cứu về quy trình điều chế Magnesi lactat bằng phƣơng pháp sinh tổng hợp, có thể sơ bộ đƣa ra một số bàn luận sau:
4.1. Về phƣơng pháp đo OD600 để á định mật độ tế o VSV
Có nhiều phƣơng pháp định lƣợng số lƣợng vi sinh vật trong mẫu nhƣ: phƣơng pháp đếm trực tiếp, đếm khuẩn lạc, đếm khuẩn lạc trên màng lọc, phƣơng pháp MPN (most probale number) và phƣơng pháp đo độ đục. Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp có những ƣu nhƣợc điểm và áp dụng cho các trƣờng hợp khác nhau. Chẳng hạn, phƣơng pháp đếm trực tiếp, áp dụng cho các tế bào có kích thƣớc lớn nhƣ nấm men, tảo… Chúng đƣợc xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc, cho phép đếm đƣợc mật độ VSV cao, khoảng 150 đến 300 khuẩn lạc, nhƣng có nhƣợc điểm là không định lƣợng đƣợc những VSV quá nhạy nhiệt, không xác định đƣợc hình dạng khuẩn lạc nhất định, khó làm thuần một dòng VSV, tốn công, tốn thời gian… Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc và phƣơng pháp MPN (most probale number) phải có phƣơng tiện và dụng cụ đi kèm, không sẵn có trong phòng thí nghiệm của bộ môn.
Nghiên cứu chọn phƣơng pháp đo độ đục tại bƣớc sóng 600 nm, vùng ánh sáng nhìn thấy. Dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lửng trong qua lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của chúng làm chúng phân tán chùm ánh sáng tới. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập quan hệ tuyến tính giữa chúng. Mật độ vi sinh vật có thể đƣợc đo trực tiếp thông qua máy đo độ đục (máy quang phổ đo ở bƣớc sóng 600nm) [30].
Hệ số tƣơng quan R2 = 0,98 cho thấy mối tƣơng quan chặt chẽ của giá trị OD600 (trong khoảng 0,01 đến 0,15) với số lƣợng VSV đếm đƣợc bằng
60
phƣơng pháp khuẩn lạc. Các kết quả mẫu cần đo đƣợc pha loãng để xây dựng đƣờng chuẩn và giá trị OD đo đƣợc đều thỏa mãn điều kiện nằm trong khoảng 0 – 0,4 [30].
Với môi trƣờng lên men chứa sữa thì với lƣợng sữa 2,6% thì sau 24 giờ lên men L.acidophilus đã đồng hóa hoàn toàn lactose [6], do đó đối với những mẫu này thì chỉ đo OD600 sau 24 giờ.
4.2. Về ảnh hƣởng ủa ionMg2+ trong môi trƣờng nuôi ấy
Sự có mặt của MgCO3 ngay thời điểm ban đầu với lƣợng lớn làm cho môi trƣờng có pH kiềm từ 9 – 10. Đây không phải là khoảng pH thích hợp cho L.acidophilus tồn tại và phát triển [2], [5], [6], [7], [9]. Kết quả cho thấy mật độ vi sinh vật rất thấp (OD600 giảm từ 0,052 đến còn 0,023 - 0,007), chứng tỏ MgCO3 đã ức chế sự phát triển củ L.acidophilus ngay từ những thời điểm ban đầu, lƣợng sinh khối giảm sẽ ảnh hƣởng đến toàn bộ quá trính phát triển và sinh trƣởng sau đó. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn nghiên cứu lại sinh acid lactic, nên khi có mặt một chất có tính kiềm thì sẽ trung hòa đƣợc acid lactic mới sinh và chuyển thành dạng muối Magnesi lactat tan đƣợc, trong môi trƣờng lại xuất hiện ionMg2+ ở dạng muối tan. Do đó, nghiên cứu chọn muối tan MgSO4, một dạng muối không làm thay đổi nhiều pH môi trƣờng nuôi cấy (pH = 7), để nghiên cứu tác động của nồng độ ionMg2+ đến sự phát triển của vi sinh vật, còn chọn MgCO3 làm chất đệm bổ sung với nồng độ thấp để hạn chế ảnh hƣởng đến pH của môi trƣờng.
Nồng độ MgSO4 và MgCO3 nghiên cứu tƣơng đƣơng với lƣợng ion
Mg2+ từ 0,5% đến 2,0%. Phù hợp với nghiên cứu của Ronan [59], tiến hành
nuôi cấy chủng L. brevis và chủng L. plantarum ATCC 4080 trong môi trƣờng MRS có bổ sung muối MgSO4 với nồng độ 0,5; 1,25 và 1,5 g trong 100ml dịch nuôi cấy. Nghiên cứu của Bautista [17] bổ sung MgCl2 (nồng độ 17,5 g/lit cho môi trƣờng nuôi cấy L. pentosus.
61
Sau 24 giờ, trong sinh khối lên men nồng độMg2+ bị giảm đi nhiều, đặc biệt khi bổ sung dạng muối tan MgSO4 điều này phù hợp với nghiên cứu của Ronan, sau 24 giờ, sinh khối chủng L. brevis chứa 5,82%Mg2+ và chủng Lb. plantarum ATCC 4080 chứa 3.29% Mg2+. Chứng tỏ, vi sinh vật đã hấp thu ionMg2+ ở dạng muối [59].
Nồng độ ionMg2+ tăng, nhƣng số lƣợng vi sinh vật thì thay đổi không đáng kể, OD600 tăng nhẹ từ 0,103 lên tới 0,115 khi nồng độ Mg2+ tăng từ 0 đến 0,5 % và chỉ giảm nhẹ từ 0,115 đến 0,069 khi tăng nồng độMg2+ lên đến 1,5 %, sau đó giữ cân bằng khi nồng độMg2+ tiếp tục tăng. Kết quả cũng phù hợp với kết luận của nghiên cứu nêu trên [17], [59].
Thêm vào đó, khi nồng ionMg2+ tăng trong môi trƣờng nuôi cấy làm cho khả năng sinh acid lactic tăng mạnh (nồng độ axít lactic tăng từ 1,396% lên tới 3,924%). Điều này có thể lý giải, vì Magnesi trong ngoại bào vận chuyển qua màng tế bào không phải do chênh lệch nồng độ mà là chủ yếu bởi sự khuếch tán sau khi thay đổi điện thế màng tế bào [68]. Khả năng liên kết của magnesi với vi khuẩn Gram dƣơng là do hàm lƣợng acid teichoic và peptidoglycan trong vách tế bào của vi khuẩn, Mg2+ tạo thành cầu nối giữa các nhóm phosphate trong chuỗi acid teichoic nằm liền kề với nhau trong thành tế bào [45]. Mg2 +, đó là các cation hóa trị hai có nhiều nhất trong các tế bào sống, đƣợc coi là một chất cân bằng nội môi quan trọng, có liên quan đến tình trạng sinh lý và tình trạng dinh dƣỡng [34], [50]. Đồng thời, Magnesi là một yếu tố gây ảnh hƣởng nhiều đến chức năng tế bào, ảnh hƣởng đến vận chuyển ion kali và Calci, trong chuyển hóa năng lƣợng và phân chia. Nó là yếu tố đồng xúc tác cho các phản ứng của khoảng 300 enzym, đặc biệt là các nucleotid, phosphor transferase, ATPase, cần thiết cho các phản ứng hóa sinh, quá trình chuyển hóa năng lƣợng [61]. Magnesi tƣơng tác với phức hợp enzym - chất nền, vai trò nhƣ là một đồng yếu tố với ATP và ảnh hƣởng đến
62
những thay đổi về enzym nó ảnh hƣởng đến hoạt động của enzym [67] và có thể là một yếu tố tốt cho kỳ ổn định của các tế bào [27], [40].
Khi môi trƣờng nuôi cấy chứa ionMg2+ không những không ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật, mà còn tăng khả năng sinh trƣởng và sinh acid lacic. Vì vậy, nghiên cứu đã sử dụng muối của Magnesi làm cơ chất tạo Magnesi lactat, vừa làm chất trung hòa acid lactic mới sinh giúp suy trì pH của môi trƣờng thích hợp vừa nhƣ một chất khoáng giúp cho sự sinh trƣởng, chuyển hóa của vi sinh vật. Điều này cũng dễ hiểu khi sử dụng chủng khuẩn vi vừa có lợi cho đƣờng tiêu hóa vừa bổ sung ionMg2+ cho cơ thể [59].
4.3. Về điều kiện l n men sinh tổng hợp Magnesi la tat.
4.3.1. Về ảnh hưởng của pH
Kết quả nghiên cứu pH thích hợp cho quá trình nuôi cấy cho thấy với môi trƣờng MRS có bổ sung sữa 2,6%, tại pH duy trì = 6,0 sau 24 giờ nuôi cấy mật độ vi sinh vật trong dịch nuôi cấy đạt giá trị cao nhất (OD600 = 1,61 vì giá trị này pha loãng 10 lần đo đƣợc 0,161). Đồng thời sản phẩm thu đƣợc cũng có hiệu suất cao nhất 72,56%. Điều này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố về sinh lý của L. acidophilus cho thấy pH 6,0 thích hợp cho quá trình phát triển [1], [5] và khi nuôi cấy sinh tổng hợp acid lactic thu sản phẩm Magnesi lactat [14], [18], [38].
Bản chất của L. acidophilus là vi khuẩn sinh acid lactic nên khi môi trƣờng nuôi cấy có pH trung tính hoặc hơi kiềm (pH = 7,0 – 8,5) thì acid lactic do vi sinh vật sinh ra sẽ làm giảm dần pH của môi trƣờng và ít tác động đến khả năng sinh trƣởng của tế bào. Tại môi trƣờng pH 7 lại sử dụng nhiều Magnesi carbonat để bổ sung mà hiệu suất thu sản phẩm lại không cao.
Trƣờng hợp môi trƣờng nuôi cấy có pH quá acid (≤ 5) thì acid lactic sinh sẽ làm pH của môi trƣờng càng acid và tác động bất lợi đến khả năng sinh trƣởng của tế bào, làm giảm mạnh mật độ tế bào OD600 từ 0,052 sau 24 h tại pH 3; 3,5; 4,0 OD600 giảm tƣơng ứng với giá trị 0.037; 0,047; 0,063.
63
Đồng thời tại môi trƣờng pH 5 hiệu suất sản phẩm thu đƣợc (55,47%) lớn hơn tại môi trƣờng pH 7 (50,53%), điều này chứng tỏ chủng vi khuẩn nuôi cấy là chủng ƣa acid và tại môi trƣờng acid cũng thu đƣợc sản phẩm nhiều hơn.
Lƣợng Magnesi carbonat bổ sung tại pH 7 nhiều nhất (3,69 mg) so với pH 5 và 6 chỉ bổ sung đƣợc 2,52 g và 3,19 g, có thể do MgCO3 tan vào trong môi trƣờng nƣớc thì phản ứng với CO2 tạo thành Mg(HCO3)2. Magnesi bicarbonate mang tính kiềm tan đƣợc trong nƣớc đƣa pH dịch nuôi cấy lên khoảng 7,0 khiến lƣợng Magnesi carbonat bổ sung lớn hơn.
4.3.2. Về phương pháp bổ sung MgCO3
Kết quả so sánh hai phƣơng pháp bổ sung MgCO3 ngay thời điểm ban đầu và sau mỗi 24 giờ nuôi cấy (duy trì pH 6) cho thấy phƣơng pháp bổ sung dần MgCO3 cho hiệusuất thu sản phẩm cao hơn, đạt tới 67,9% trong khi hiệu suất thu Magnesi lactat khi bổ sung MgCO3 ngay thời điểm ban đầu chỉ đạt 22,1%. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố [37], [54]. Tuy MgCO3 không tan trong dung dịch nƣớc nhƣng lại tạo pH kiềm. Bổ sung một lƣợng lớn MgCO3 vào môi trƣờng nuôi cấy ngay thời điểm ban đầu sẽ tạo pH kiềm là điều kiện bất lợi cho vi sinh vật tạo acid lactic, bổ sung dần MgCO3
vừa không tạo pH quá kiềm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh acid lactic của vi khuẩn, đồng thời lƣợng acid lactic sinh ra làm giảm pH môi trƣờng lại đƣợc phản ứng với MgCO3 mớibổ sung vào dễ tạo sự ổn định pH trong quá trình nuôi cấy.
Trên thế giới, hầu hết các quá trình sản xuất acid lactic dựa trên quá trình lên men của các carbohydrat bởi vi khuẩn [18], [38], [54]. Các quá trình này đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và độ pH. Một đặc điểm phổ biến cho tất cả các quá trình lên men là phải trung hòa các acid đƣợc tiết ra bởi các vi khuẩn trong quá trình này. Sự sụt giảm pH tùy thuộc vào loại vi khuẩn đƣợc sử dụng, có thể làm hỏng quá trình trao đổi chất của vi khuẩn và quá trình lên men dừng lại. Vì vậy, ngƣời ta thƣờng thêm Ca(OH)2 vào dịch lên
64
men và thu đƣợc canxi lactat, hiệu suất của quá trình này thƣờng thấp, tách acid lactic có độ tinh khiết cao vẫn còn là một mục tiêu khó [18]. Ngoài ra, việc sử dụng acid sunfuric để giải phóng acid lactic từ canxi lactat sau đó tạo ra canxi sulfat là chất thải rắn (thạch cao) ảnh hƣởng tới môi trƣờng [18]. Do vậy, nghiên cứu có thể ứng dụng để làm giai đoạn trung gian tạo ra ra phƣơng pháp sản xuất aicd lactic thân thiện môi trƣờng thông qua sản xuất Magie lactat. Sinh khối tách ra và các dịch rửa đƣợc tái chế để lên men. Các phần của sinh khối mà không tái chế đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất thu đƣợc từ thiết bị bay hơi, và đƣợc sử dụng nhƣ phụ gia thức ăn cho gia súc hoặc khí đốt [18].
Các chất bổ sung tƣơng tự nhƣ MgCO3 có thể là Mg(OH)2 [18], [54] hoặc MgO [38] hoặc Magnesi bicacbonat [14]. Tuy nhiên, vì MgCO3 là một chất có sẵn trong phòng thí nghiệm của bộ môn công nghiệp dƣợc – ĐH Dƣợc HN, nên nghiên cứu chƣa có điều kiện thực hiện với các chất đệm trên.
4.3.3. Về các loại hydratcarbon