Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng
Thiết bị, dụng cụ Nguồn gốc, xuất xứ
Nồi hấp ALP, Nhật
Tủ cấy Sanyo, Nhật
Tủ ấm Memmert, Đức
Tủ sấy Daihan, Hàn Quốc
Máy li tâm Hettich, Đức
Bếp cách thủy HHS, Trung Quốc
Tủ lạnh Daewoo, Hàn Quốc
Máy đo pH Eutech instrument pH150 (Anh).
Máy đo quang Hitachi U-1800, Nhật
Máy đo hàm ẩm Ohaus- Mỹ
2.2. Nội ung nghi n ứu
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp Magnesi lactat quy mô phòng thí nghiệm.
Xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 và mật độ tế bào.
Khảo sát ảnh hƣởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L. acidophilus.
25
Khảo sát và lựa chọn phƣơng thức bổ sung Magnesi cacbonat - Bắt đầu quá trình lên men.
- Trong quá trình lên men.
Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy: 5 - 7
Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn hydratcarbon: glucose, lactose, saccarose, maltose.
Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ glucose: 2% - 11% Lựa chọn thời điểm thích hợp thu sản phẩm.
2.2.2. Khảo sát và lựa chọn một số phƣơng pháp và điều kiện kết tinh thu sản phẩm Magnesi lactat.
Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp kết tinh: tự kết tinh, tạo mầm. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh: 0 – 4oC, 25 – 30oC, 37oC. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian kết tinh: 1 giờ, 6 giờ, 18 giờ, 24 giờ,
48 giờ.
Đề xuất quy trình xử lý dịch lên men quy mô phòng thí nghiệm.
2.2.3. Xác định cấu trúc và kiểm nghiệm Magnesi lactat theo tiêu chuẩn Dƣợc Điển Anh 2010.
Xác định cấu trúc hóa học: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phân tử (MS), cộng hƣởng từ proton (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nƣớc.
26
2.3. Phƣơng pháp nghi n ứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống và nuôi cấy
2.3.1.1. Phƣơng pháp nhân giống:
Môi trƣờng nhân giống (bảng 2.2) sau khi đƣợc tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội xuống 40 – 450C cấy chủng L. acidophilus. Ủ trong tủ ấm CO2 5%, ở nhiệt độ 370C. Sau 24 giờ nuôi cấy đƣợc giống cần thiết.
Trƣờng hợp giống đƣợc giữ ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh) lâu ngày thì phải đƣa giống về trạng thái hoạt động bằng cách ủ trong tủ ấm nhiệt độ 370C trong 2 - 3 ngày rồi tiến hành các bƣớc nhƣ trên [6].
2.3.1.2. Phƣơng pháp lên men thu Magnesi lactat:
Chuẩn bị 100ml môi trƣờng lên men (bảng 2.2) với các thành phần và tỉ lệ nghiên cứu vào các bình nón 250ml. Các thành phần yêu cầu tiệt trùng riêng biệt thì pha riêng. Tiệt trùng môi trƣờng ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ khoảng 40 – 450C, trộn lẫn các thành phần tiệt trùng riêng. Sau đó cấy giống vào các bình này trong tủ cấy vô trùng với tỉ lệ giống là 10% [6].
Sau khi cấy giống, để lên men tĩnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C, thỉnh thoảng lắc. Bổ sung MgCO3 ngay thời điểm ban đầu hoặc sau mỗi 24 giờ. Sau 96 giờ, thu lấy dịch lên men để kết tinh Magnesi lactat.
2.3.2. Phương pháp tách chiết Magnesi lactat từ dịch lên men
Dịch lên men đƣợc đun cách thủy ở nhiệt độ 800C trong 20 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Lọc nóng, loại tủa và các thành phần không tan. Bổ sung 2% (kl/tt) than hoạt vào dịch lọc để tẩy màu, đun cách thủy 10 phút sau đó lọc nóng bằng phễu Buchner loại bỏ than hoạt. Cô cách thủy dịch lọc đến còn 30% thể tích. Kết tinh, lọc, thu tinh thể, rửa 2 lần bằng nƣớc cất đã để lạnh. Sản phẩm màu trắng, đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 400
C trong 24 giờ. Cân lƣợng sản phẩm thu đƣợc [19].
27
2.3.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật
2.3.3.1. Phƣơng pháp đếm đếm khuẩn lạc định mật độ tế bào vi sinh vật. Nguyên tắc: Xác định số lƣợng vi sinh vật còn sống có trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc [21].
Tiến hành:
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trƣờng MRS đặc (nêu trong bảng 2.2). Hòa tan các thành phần tan trong nƣớc, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình đựng môi trƣờng ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trƣờng lên các đĩa petri đã đƣợc rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng, để nguội, chờ đông rắn rồi đậy nắp kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nƣớc muối sinh lý, đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 20 phút, để nguội. Lắc đều bình lên men. Dùng pipet hút chính xác 1ml dịch cần định lƣợng vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, sau đó từ ống nghiệm thứ nhất lại hút chính xác 1ml cho vào ống nghiệm thứ tiếp theo. Mẫu tế bào cần đo đem pha loãng mẫu theo dãy thập phân 10-6
đến 10-11. Hút 0,5ml tƣơng ứng ở mỗi nồng độ pha loãng vào mỗi đĩa (lặp lại 3 lần đối với mỗi độ pha loãng) và đổ môi trƣờng dinh dƣỡng tƣơng ứng vào mỗi đĩa (môi trƣờng đã đƣợc khử trùng, để nguội 37oC). Ủ các đĩa này trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37oC. Tiến hành định lƣợng số vi sinh vật trên các mẫu, sau 48 giờ đọc kết quả. Số lƣợng VSV có trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy ban đầu đƣợc tính theo công thức:
28 Trong đó:
X: số vi sinh vật có trong 1 ml mẫu.
An: số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng thứ n. 2.3.3.2. Phƣơng pháp đo độ đục OD định mật độ tế bào vi sinh vật
Nguyên tắc: dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lửng trong qua lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của chúng làm chúng phân tán chùm ánh sáng tới. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập quan hệ tuyến tính giữa chúng. Mật độ vi sinh vật có thể đƣợc đo trực tiếp thông qua máy đo độ đục (máy quang phổ đo ở bƣớc sóng 600nm) [30].
Tiến hành:
- Xác định độ đục OD: Lấy 10ml dịch lên men sau 24 giờ, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Trong trƣờng hợp, dịch lên men có chứa MgCO3, không tan, thêm H2SO4 0,1N để tạo thành dạng muối MgSO4 tan trong nƣớc, không ảnh hƣởng đển độ đục của dịch đem đo. Bỏ dịch lên men thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng nƣớc muối sinh lý. Bổ sung nƣớc muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml trong ống ly tâm. Tiến hành pha loãng mẫu với hệ số pha loãng khác nhau và đo OD600 ứng với các hệ số pha loãng đó.
- Định lƣợng số tế bào vi khuẩn ban đầu trong dịch nuôi cấy tăng sinh sau 24 giờ bằng phƣơng pháp nhƣ mục: 2.3.3.1. đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng đĩa thạch.
- Từ các giá trị OD600 tƣơng ứng và các giá trị mật độ tế bào pha loãng (cách pha loãng nhƣ trong bảng 2.4) tiến hành lập phƣơng trình biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa mật độ tế bào (số tế bào/ml) và độ hấp thu OD600.
29
Bảng 2.4. Các nồng độ pha loãng để xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào Ống thí nghiệm Mẫu trắng 1 2 3 4 5 6 7 8 Mẫu dd (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 NaCl 0.9% 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0
- Xác định mật độ tế bào theo trị số OD600 của các mẫu có mật độ tế bào vi sinh vật tƣơng ứng cần đo đƣợc (pha loãng mẫu cầu đo sao cho trị số OD600
nằm trong khoảng tuyến tính), kết hợp với đồ thị vừa lập cho phép ta xác định mật độ tế bào trong dịch nuôi.
2.3.4. Phương pháp tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat
Nguyên tắc: Dựa trên nồng độ đƣờng tiêu thụ để tính hiệu suất tạo sản phẩm.
C6H12O6 2CH3–CHOH–COOH (CH3–CHOH–COO)2Mg.2H2O
Mglucose = 180 MMagnesi lactat dihydrat = 238
Từ kết quả định lƣợng đƣờng trong mẫu khởi điểm và kết thúc, tra bảng ta đƣợc nồng độ % đƣờng trong 2 mẫu, từ đó tính đƣợc lƣợng đƣờng tiêu thụ.
Dựa trên hiệu suất tiêu thụ đƣờng, tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat theo công thức:
Trong đó:
H: hiệu suất (%).
m: số gam Magnesi lactat/100ml dịch lên men.
a: C% glucose khởi điểm. b: C% glucose kết thúc.
30
2.3.5. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của sản phẩm
Sản phẩm Magenesi lactat đƣợc xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nƣớc bằng cách đo khối lƣợng mất do nƣớc bay hơi.
- Phổ hồng ngoại (IR): phổ IR đƣợc ghi trên máy Shimadzu trong vùng 4000 – 400 cm-1. của Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [4], [10].
- Phổ khối lƣợng (MS): phổ MS đƣợc ghi theo phƣơng pháp ESI (ion âm) trong dung môi Methanol, đƣợc ghi trên máy LCMS – 2010EV (Shimadzu) tại phòng Thí nghiệm Hoá vật liệu - Khoa Hoá học - Trƣờng ĐHKHTN – ĐHQGHN [4], [10].
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR): phổ 1H-NMR đƣợc ghi trong D2O trên máy Brucker Av – 500 MHz, chất chuẩn tetramethylsilan tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dùng D2O làm dung môi [4], [10].
- Xác định công thức muối ngậm nƣớc: xác định khối lƣợng nƣớc mất do bay hơi bề mặt: dùng máy đo hàm ẩm. Cân khoảng 0,5 g bột, cho vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 1050C, theo dõi và đọc kết quả.
Xác định khối lƣợng nƣớc mất do bay hơi phân tử nƣớc đã ngậm: Lấy khoảng 0,5g bột đã làm bay hơi nƣớc bề mặt, cho vào đĩa cân phân tích, đọc kết quả. Sau đó sấy trong tủ sấy ở 125oC trong khoảng 24 giờ đến khi khối lƣợng không đổi, theo dõi và đọc kết quả [25].
Sản phẩm Magnesi L - lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại dạng hydrat C6H10MgO6.nH2O. Tính số phân tử nƣớc ngậm theo công thức sau:
31 Trong đó:
H: Khối lƣợng nƣớc mất do bay hơi
m: Khối lƣợng bột khô sau khi đã bay hơi nƣớc bề mặt. Msp: khối lƣợng phân tử Magnesi lactat
Mnc: Khối lƣợng phân tử của nƣớc
2.3.6. Phương pháp kiểm nghiệm Magnesi lactat
Sản phẩm đã tinh chế đƣợc định tính, định lƣợng và kiểm tra chất lƣợng theo chuyên luận Magnesi lactat trong Dƣợc điển Anh BP 2010 [22] và Dƣợc điển Việt Nam IV [3].
2.3.6.1. Phƣơng pháp định tính các ion lactat và magie
Thử định tính ion lactat: Hòa tan khoảng 20mg chế phẩm trong 5ml nƣớc, thêm 1 ml nƣớc brom và 0,5ml dung dịch acid sulfuric 1M. Đun cách thủy đến khi mất màu, thỉnh thoảng khuấy bằng đũa thủy tinh. Thêm 4g amoni sulfat, trộn đều. Thêm từng giọt theo thành ống nghiệm 0,2ml dung dịch natri nitroprusiat 10% trong acid sulfuric 1M (không trộn) và 1ml amoniac đậm đặc. Để yên 30 phút sẽ có vòng màu lục giữa bề mặt 2 chất lỏng [22].
Thử định tính ion magnesi: Hòa tan 15mg chế phẩm trong 2ml nƣớc. Thêm 1ml dung dịch NH3 6M, tạo tủa trắng. Tủa trắng tan khi thêm 1ml dung dịch amoni clorid. Thêm 1ml dung dịch Na2HPO4 9% có tủa kết tinh trắng [22].
2.3.6.2. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel G.
Dung môi khai triển: Isopropanol - nƣớc - amoniac đậm đặc (85 : 20 : 1). Dung môi hòa tan: Dung dịch HCl 0,01M - methanol (70 : 30).
Dung dịch thử: hòa tan 0,2g Magnesi lactat điều chế đƣợc trong dung môi hòa tan ở nhiệt độ 70C đến 80°C, làm nguội và thêm dung môi hòa tan vừa đủ 10 ml, lọc.
32
Dung dịch đối chiếu: hòa tan lƣợng bột viên (viên nén Magie B6 – Mekophar hàm lƣợng 470 mg magnesi lactat dihydrat) tƣơng đƣơng khoảng 0,2g Magnesi lactat dihydrat trong dung môi hòa tan ở nhiệt độ 70C đến 80C, làm nguội và thêm dung môi hòa tan vừa đủ 10 ml, lọc [3].
Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl mỗi dung dịch. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi khoảng 10cm, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí, phun dung dịch kali pemanganat 1%, quan sát bằng mắt thƣờng. Vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tƣơng ứng về vị trí và màu sắc với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu [3].
Hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
Trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm.
2.3.6.3. Phƣơng pháp định lƣợng Magnesi lactat theo ion Mg2+
Cân chính xác một lƣợng bột tƣơng đƣơng khoảng 0,25 g Magnesi lactat dihydrat vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 80 ml nƣớc, lắc siêu âm 15 phút.
Làm nguội và thêm nƣớc tới vạch định mức, lắc đều, lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 50,0 ml dịch lọc thêm 5 ml dung dịch đệm ammoniac pH 10 và 50 mg hỗn hợp đen eriocrom T. Đun nóng khoảng 40 oC và chuẩn độ bằng dung dịch trilon B 0,05 M đến khi chuyển sang màu xanh. Tiến hành song song với một mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml dung dịch trilon B 0,05 M tƣơng đƣơng với 11,92 mg C6H10MgO6.2H2O [3], [22].
33
2.3.7. Phương pháp định lượng acid lactic
Nguyên tắc: lƣợng acid lactic có trong mẫu có thể đƣợc biểu diễn bằng độ Thermer, đây chính là số ml dung dịch NaOH dùng để trung hòa lƣợng acid lactic có trong 100ml dung dịch mẫu. Dung dịch phenolphtalein 1% trong môi trƣờng acid không màu, khi lƣợng acid bị trung hòa bởi NaOH thì dung dịch chuyển sang màu hồng. Dựa vào sự chuyển màu xác định đƣợc lƣợng NaOH cần dùng [70].
Tiến hành: Cho 10ml dịch nuôi cấy vào bình nón, thêm nƣớc cất cho đủ 100mL. cho vào mẫu 1ml phenolphthalein. Dùng NaOH 0,1N chuẩn độ đến khi trong có màu hồng không phai thì ngừng lại.
Công thức tính độ Thermer To To= n.100/V
n: lƣợng NaOH để trung hòa 100ml dung dịch mẫu (ml) V: thể tích mẫu (ml)
Lƣợng acid lactic có trong mẫu: A%= T0
x 0.009 (g/100ml)
2.3.8. Phương pháp Schoorl – Regenbogen định lượng đường
Nguyên tắc: Xác định lƣợng đƣờng tiêu thụ và hiệu suất chuyển hóa đƣờng sinh lactat, định lƣợng đƣờng khởi điểm và đƣờng kết thúc.
Tiến hành:
Lấy chính xác 1ml dịch môi trƣờng lên men ban đầu khi chƣa cấy giống (hoặc dịch lên men khi kết thúc), cho vào đó 0,5ml dung dịch acid oxalic 5%. Lọc loại tủa qua phễu lọc Buchner. Rửa phễu bằng 5 – 10ml nƣớc cất. Thêm vào dịch lọc chính xác 10ml dung dịch Schoorl A và 10ml dung dịch Schoorl B. Thêm nƣớc cất để đạt tổng thể tích 50ml. Đun sôi 2 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng, thêm 3g KI lắc tan hoàn toàn, bổ sung 10ml dung dịch H2SO4 25%, giải phóng I2 cho dung dịch màu nâu. Chuẩn độ I2 giải phóng ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N với chỉ thị hồ tinh bột 2%. Mẫu trắng làm tƣơng tự nhƣng thay dịch lên men bằng nƣớc cất. Hiệu số giữa số mililit
34
dung dịch Na2S2O3 0,1N tiêu thụ cho mẫu trắng (V0) và mẫu thử (V) cho ta số ml Na2S2O3 0,1N tƣơng ứng với lƣợng đƣờng tiêu thụ cần xác định. Tra bảng phụ lục tìm đƣợc lƣợng đƣờng đó [6].
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu đƣợc lƣu trữ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007.
- Mẫu đƣợc biểu diễn dƣới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Xtb ± SD). Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 với kiểm định t – Test hoặc ANOVA ONE WAY và hậu kiểm Turkey để so sánh sự khác biệt các giá trị trung bình của các thí nghiệm. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
35
Chƣơng 3. ẾT QUẢ
3.1. hảo sát v lựa họn một số điều kiện ảnh hƣởng đến quá trình lên men L. acidophilus sinh tổng hợp Magnesi la tat.
3.1.1. Xây dựng phương trình tương quan tuyến tính giữa độ OD600 và mật độ tế bào
Nuôi cấy L. acidophilus trong môi trƣờng MRS theo phƣơng pháp mô