Ở cùng nồng độ 2% sau 96 giờ, vi khuẩn cũng tiêu thụ hoàn toàn saccarose, lactose và maltose thể hiện qua quá trình định lƣợng không còn thấy đƣờng dƣ ở dịch lên men, hiệu suất sinh Magnesi lactat khi sử dụng saccarose là khá cao (68,2%). Tuy nhiên, quá trình thực nghiệm nhận thấy, vi khuẩn lên men saccarose chậm, có thể do chúng cần thời gian và năng lƣợng để chuyển hóa saccarose thành loại đƣờng đơn dễ tiêu thụ hơn. Điều này xảy ra tƣơng tự khi dùng Maltose làm nguồn hydratcacbon (61,06%). Cụ thể, sau 48 giờ pH ở các bình nuôi cấy khác vẫn xuống thấp khoảng 3,5 – 4, còn bình nuôi chứa saccarose, maltose pH không hạ hoặc hạ rất ít, ở mức 5 – 6, do vậy khi thực hiện lên men ở quy mô lớn và tăng nồng độ đƣờng lên sẽ kéo dài thời gian lên men, tăng khả năng nhiễm. Vi khuẩn cũng đồng hóa lactose rất nhanh bởi thông thƣờng lactose là nguồn hydratcacbon thích hợp nhất cho vi khuẩn
65
lactic nói chung và L. acidophilus nói riêng, nhƣng hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat không cao (63,48%).
Khả năng sử dụng MgCO3 làm chất đệm, cũng nhƣ chỉ số OD600 đo mật độ vi sinh vật giữa các loại đƣờng khác nhau không có ý nghĩa thông kê, hay nói cách khác không khác nhau, p của khối lƣợng MgCO3 sử dụng = 0,435 (> 0,05), p của khối lƣợng OD600 sử dụng = 0,321(> 0,05) . Có thể suy đoán rằng, sự phát triển sinh khối và khả năng hấp thụ ion Mg2+ của môi trƣờng nuôi cấy L. acidophilus chứa các loại đƣờng khác nhau lại không khác biệt, nhƣng khả năng sinh acid lactic tạo sản phẩm Magnesi lactat là khác nhau, p- value của hiệu suất = 0,006 (<0,05).
Hiệu suất tạo sản phẩm ở môi trƣờng đƣờng glucose cao nhất (90,56%) có thể giải thích là do môi trƣờng nhân giống sử dụng glucose 4% làm nguồn hydratcacbon chính nên vi sinh vật quen với môi trƣờng chứa glucose, khi chuyển sang môi trƣờng lên men vi sinh vật dễ thích nghi. Hơn nữa, glucose phổ biến, giá thành rẻ vì dễ dàng thu đƣợc từ thủy phân rỉ đƣờng và các phế phẩm trong các ngành công nghiệp khác, nên thƣờng đƣợc chọn làm nguồn hyratcacbon chính trong sinh tổng hợp Magnesi lactat.
4.3.4. Về nồng độ đường glucose
Trong lên men công nghiệp, nồng độ hydratcarbon thƣờng dùng từ 5 – 20%, điều kiện lên men liên lục thƣờng sử dụng nồng độ glucose 6 % [7], điều kiện lên men gián đoạn (lên men theo mẻ) thì khả năng lên men còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố của môi trƣờng dinh dƣỡng nhƣ nguồn nitơ giúp vi khuẩn tăng trƣởng đáng kể do vậy lƣợng acid lactic sinh ra cũng tăng theo [2], [7].
Ở môi trƣờng MRS chứa nồng độ glucose 2%, nghiên cứu sử dụng cùng một môi trƣờng giàu dinh dƣỡng so với số lƣợng vi sinh vật [2],[7], nên chúng đã tiêu thụ hết glucose sau thời gian 96 giờ với hiệu suất tạo sản phẩm cao nhất (90,56%).
66
Khi lƣợng glucose tăng từ 5% đến 11% thì lƣợng sản phẩm thu đƣợc tăng dần, tuy nhiên hiệu suất tiêu thụ glucose chỉ tăng đến 9% (56,56% đến 72,4%). Sau đó đến khi nồng độ glucose tăng đến 11%, tỷ lệ dinh dƣỡng khác so với đƣờng bị giảm đi, đồng thời kéo dài thời gian lên men, do đó thời gian lên men 96 giờ là không đủ để vi khuẩn chuyển hóa hết glucose, thể hiện ở kết quả định lƣợng: glucose vẫn dƣ sau 96 giờ tại môi trƣờng chứa nồng độ đƣờng 11%.
Tuy nhiên, nếu chọn nồng độ đƣờng glucose 2% thì tỷ lệ khối lƣợng sản phẩm/ thể tích dịch lên men là quá thấp và tốn kém các thành phần môi trƣờng khác. Do đó với cùng các thành phần môi trƣờng lên men nhƣ nhau, nghiên cứu mong muốn tăng nồng độ đƣờng sử dụng lên mà thu đƣợc Magnesi lactat với hiệu suất cao nhất. Khi nồng độ đƣờng đạt mức 9% thì hiệu suất tạo sản phẩm cao (72,14%) so với khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc lớn nhất.
Tiếp tục tăng nồng độ đƣờng glucose lên 11% thì hiệu suất sử dụng đƣờng của vi sinh vật có xu hƣớng giảm (47,5%), điều này có thể giải thích là do nồng độ đƣờng cao ức chế sự phát triển của vi sinh vật (có khả năng làm môi trƣờng ƣu trƣơng, mất cân bằng trao đổi chất sinh học của màng tế bào vi khuẩn, làm tế bào mau già hóa,…). Hoặc có thể là do Magnesi lactat là hợp chất ít tan trong nƣớc ở nhiệt độ thƣờng 1g bột tan trong 25ml nƣớc lạnh, có nghĩa bình lên men 100ml thì chỉ chứa; 3,5ml nƣớc nóng). Nồng độ đƣờng càng cao thì Magnesi lactat sinh ra càng nhiều, tới nồng độ quá bão hòa nó sẽ kết tinh ngay trong bình lên men ở 370C (môi trƣờng lên men chƣa lọc chứa rất nhiều hạt nhân kích thích sự kết tinh nhƣ bụi, tế bào, tủa Magnesi carbonat chƣa phản ứng hết,…), làm cản trở hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Không những thế, khi xử lý dịch lên men, nhiệt độ đun cách thủy chỉ là 800C, các tinh thể Magnesi lactat đã kết tinh lẫn trong sinh khối, khó có thể thể hòa tan trở lại vào dịch lên men gây thất thoát khi lọc bằng phễu Buchner. Hơn
67
nữa, lƣợng đƣờng dƣ lớn sẽ gây khó khăn cho quá trình kết tinh, dịch cô đặc nhớt do đƣờng bị caramen hóa, khó lọc…
Do vậy, nếu chọn nồng độ đƣờng glucose 9% sẽ tiết kiệm đƣợc các thành phần môi trƣờng nuôi cấy khác và hiệu suất thu sản phẩm cao phù hợp với điều kiện sản suất quy mô công nghiệp, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Peter [54].
4.3.5. Về thời gian lên men
Thời gian lên men vi sinh vật phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Trung bình thời gian lên men của mỗi mẻ sản xuất acid lactic trong công nghiệp từ 2 đến 6 ngày [2], [14], [18], [19], [38], [42], tùy thuộc vào loại VSV sử dụng, loại B. coagulans chỉ khoảng 11 đến 19 giờ [54] và cũng tùy thuộc vào mục đích thu sản phẩm dạng L hay dạng D, chủng L. acidophilus nuôi cấy 48 giờ sinh 68% acid L lactic [41], 13,5 giờ sinh 91% dang acid L lactic [31]. Sau khi đã lựa chọn các điều kiện lên men khác nhƣ: chủng vi sinh vật, loại đƣờng, nồng độ đƣờng, thời điểm bổ sung chất đệm, thì thời gian lên men là yếu tố đƣợc lựa chọn cuối cùng. Thời điểm tốt nhất thu sản phẩm là thời điểm ngắn nhất sao cho hiệu suất tiêu thụ đƣờng cao nhất. Nếu chọn thời đểm 72 giờ thì hiệu suất chỉ đạt gần 50% (46,6%) kém thời điểm 96 giờ (72,5%) là khoảng 22%, chọn thời điểm 120 giờ hiệu suất (77,7%) chỉ hơn thời điểm 96 giờ là 5%, trong khi đó nếu kéo dài thời gian lên men sẽ tăng khả năng nhiễm trùng, tốn năng lƣợng duy trì các điều kiện lên men và nhân công. Vì vậy, cân bằng những ƣu điểm và nhƣợc điểm, thông thƣờng nghiên cứu sẽ chọn thời điểm 96 giờ để làm thời điểm kết thúc quá trình lên men.
Tuy nhiên, khi nghiên cứu về điều kiện phản ứng tổng hợp thông thƣờng [74], phản ứng của acid lactic với nồng độ 22,0-33,3% trong cồn, ở nhiệt độ 70 ° C, thêm từ từ MgO cho đến khi pH trong khoảng 6,5-7,2 tỷ lệ mol phản ứng là 1: (0,05-0,08), thời gian phản ứng khoảng 2,5 giờ đến 3,0 giờ. Nhƣ vậy, áp dụng vào điều kiện phản ứng lên men, sau 72 giờ ngừng lên
68
men. Sau đó, xử lý dịch lên men theo điều kiện của phản ứng hóa học. Nghĩa là, bổ sung MgCO3 đến pH = 7,0 và đun diệt tế bào thêm 2,5 đến 3 giờ ở nhiệt độ 70o
C và làm cho phản ứng tạo sản phẩm Magnesi lactat xảy ra hoàn toàn.
4.4. B n luận về phƣơng pháp tinh hế
4.4.1. Về phương pháp kết tinh
Muối Magnesi lactat tan trung bình ở trong nƣớc (độ tan 4g/100ml trong nƣớc lạnh), độ tan kém hơn Calci lactat (độ tan 7,9g/100ml nƣớc ở 300oC) [6], [35]. Trong cùng 100 ml dịch lên men, cùng chủng giống
L.acidophilus nồng độ đƣờng 7% (kl/tt), muối Calci chỉ cần cô còn ½ thể tích, tự kết tinh ở nhiệt độ 4 – 10oC [6], trong khi đối với muối Magnesi lactat, thực hiện theo đúng quy trình sản xuất muối Calci thì không thu đƣợc một chút sản phẩm nào phải thực hiện cô cạn hơn (cô còn 30% thể tích 2,49 g sản phẩm; cô còn 1/10 thể tích đạt 4,43 g sản phẩm) hoặc tạo mầm tinh thể (6,3 g đến 6,5 g sản phẩm). Phù hợp với nghiên cứu [18], cô dịch chứa 5,5% Magnesi lactat còn 15% thể tích hay nghiên cứu khác cô còn 1/3 thể tích [74]. Điều này có thể giải thích là do quá trình kết tinh bị chi phối bởi cả hai yếu tố nhiệt động lực và động lực phân tử, trạng thái quá bão hòa trong dung dịch là chƣa đủ điều kiện để mầm tinh thể hình thành, phải vƣợt qua năng lƣợng tự do phụ thuộc bản thân phân tử muối và dung môi [55], [63] nhƣ vậy trong cùng điều kiện và dung môi, năng lƣợng tự do của muối Magnesi lactat lớn hơn nhiều so với muối Calci, hơn nữa, quá trình tạo mầm bắt đầu từ những cụm ổn định tạo thành hạt nhân, hạt nhân tạo ra đạt kích thƣớc tới hạn, mầm sẽ lớn lên để giảm năng lƣợng tự do, khi các cụm không ổn định, nó sẽ bị tái hòa tan trở lại vào dung dịch, với năng lƣợng tự do lớn, các cụm muối Magnesi kém ổn định và dễ bị hòa tan trở lại trƣớc khi đạt đƣợc kích thƣớc tới hạn của mầm, do đó tinh thể muối Magnesi khá nhỏ và mảnh, khác với muối Calci to và thô, vậy nên quá trình tạo mầm tinh thể của Magnesi lactat không thể xảy ra ở cùng nồng độ với muối Calci, mà phải cung cấp thêm năng
69
lƣợng cho quá trình này bằng cách gãi kết tinh hoặc thả mầm tinh thể đƣợc tạo sẵn vào hoặc nồng độ phải thật đậm đặc.
Thực nghiệm và các nghiên cứu cho thấy, đối với tinh thể muối Magnesi lactat, quá trình kết tinh đã là một bƣớc lọc hiệu quả [19], [54], [37]. Thí nghiệm ở bình (4) gãi kết tinh từ 2 – 5 phút, tinh thể kết tinh ồ ạt và độ tinh khiết vẫn đạt trên 95%, cao hơn phƣơng pháp tạo một vài mầm kết tinh (3) (91% đến 95%). Bên cạnh đó, hình dạng tinh thể nhỏ, mịn sẽ thuận lợi hơn ứng dụng làm tá dƣợc hay dƣợc chất trong bào chế.
4.4.2. Về nhiệt độ kết tinh
Độ tan của Magnesi lactat thay đổi theo nhiệt độ (1g/25 ml nƣớc lạnh và 1g/3,5ml nƣớc nóng [35], khoảng 1g/16ml nƣớc nhiệt độ thƣờng [74]), nhiệt độ thấp tạo điều kiện cho quá trình kết tinh xảy ra hoàn toàn, do đó lƣợng sản phẩm thu đƣợc thấp hơn khi kết tinh ở nhiệt độ 370
C (5 g), tuy nhiên hiệu suất thu sản phẩm ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh khác biệt không đáng kể (6,49 và 6,57 g tƣơng ứng), lại tiết kiệm đƣợc năng lƣợng, thiết bị nên nghiên cứu chọn nhiệt độ kết tinh là phòng 25 – 300C. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Peter Johannes Marie Baets [54], Magnesi lactat có thể kết tinh ở cả hai điều kiện làm lạnh và không làm lạnh, tuy nhiên nó thƣờng đƣợc kết tinh trong khoảng nhiệt độ từ 20 – 950C, đặc biệt là từ 50 – 900C với nguồn hydratcacbon thô, nhiều tạp, vì ở nhiệt độ cao, các tạp sẽ nằm lại trong pha lỏng, tránh đồng kết tinh với nhu và đồng kết tinh với Magnesi lactat [54].
4.4.3. Về thời gian kết tinh
Thời gian kết tinh thƣờng ảnh hƣởng đến quá trình kết tinh của tinh thể. Hầu hết các nghiên cứu đều để qua đêm hoặc sau 24 giờ mới thu tinh thể [19] song kết quả thực nghiệm của nghiên cứu cho thấy, chỉ cần ít nhất 6 giờ với phƣơng pháp gãi kết tinh 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, lƣợng Magnesi lactat thu đƣợc đã đạt mức tối đa (5,59 g), có tăng thêm thời gian kết tinh thì lƣợng
70
sản phẩm thu đƣợc cũng thay đổi không đáng kể (6,45 g), do đó nghiên cứu chọn thời gian kết tinh Magnesi lactat là 6 giờ với lƣợng sản phẩm thu đƣợc là 6,2 g.
4.5. Về định tính, á định ấu trú v kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi la tat sinh tổng hợp
4.5.1.Về định tính
Khi nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 trong môi trƣờng MRS có bổ sung MgCO3 có thể thu đƣợc Magnesi lactat. Sản phẩm sau khi tinh chế là tinh thể có màu trắng, hình kim (ảnh tinh thể -
hình 4.1), kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gerrit Leendert Nanninga (2005) đã công bố [37], Magnesi lactat có thể dễ dàng thu đƣợc từ quá trình lên men của carbohydrat thành acid lactic. Magie lactat kết tinh từ nƣớc lên men thành tinh thể khối hình thuôn dài [19].
Kết quả định tính Magnesi lactat thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng [3] cho thấy vết chính thu đƣợc trên sắc ký đồ của dung dịch thử tƣơng ứng về vị trí, màu sắc và giá trị Rf với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (Rf
= 0,67).
Hình 4.1. Hình ảnh tinh thể Magnesi lactat chụp qua kính hiển vi
71
4.5.2. Về cấu trúc của sản phẩm Magnesi lactat sinh tổng hợp
Trên phổ hồng ngoại quan sát thấy dải hấp thụ đặc trƣng của nhóm COO- tại 1610 (C=O), 1184 và 1128cm-1 (C–O). Phổ khối lƣợng cho pic phân tử m/z ở 200,9 phù hợp với công thức phân tử của Magnesi lactat C6H10MgO6
(với m = 202). Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton cho tín hiệu đặc trƣng của mảnh lactat: tín hiệu Doublet của 3 hydro nhóm –CH3 (δ=1,28 ppm), và tín hiệu quartet của 1 hydro nhóm –CH– (δ=4,09 ppm). Hằng số tƣơng tác spin – spin của các hydro này giống nhau (J = 7,0 Hz).
Kết quả xác định số phân tử nƣớc trong sản phẩm cho thấy cấu trúc sản phẩm chứa 2 phân tử nƣớc.
Từ các phân tích trên có thể khẳng định sản phẩm thu đƣợc là Magnesi lactat dihydrat có công thức cấu tạo nhƣ sau:
4.5.3. Về kiểm nghiệm
Kết quả kiểm nghiệm cho thấy sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lƣợng dƣợc điển Anh (BP 2010) [22]. Trong quá trình lên men và sau tinh chế hầu nhƣ không có các tạp hữu cơ khác nhƣ acid lactic, acid acetic, acid formic, ethanol - những sản phẩm phụ của quá trình lên men, điều này chứng tỏ chủng Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 lên men trong điều kiện thí nghiệm và phƣơng pháp tinh chế áp dụng cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic, đã kết hợp với Magnesi carbonat có trong môi trƣờng nuôi cấy để tạo thành Magnesi lactat.
Phù hợp với nghiên cứu của Gerrit Leendert Nanninga (2005), Magie lactat thu đƣợc rất tinh khiết. Do đó bất kỳ nguồn carbohydrat có thể đƣợc sử dụng, thậm chí nguồn carbohydrat tƣơng đối thô, ví dụ sucrose, tinh bột (lỏng), rỉ đƣờng [37], hay nghiên cứu của Bode Harold Eli và các cộng sự
72
(1969) đã đƣa ra quy trình tinh chế Magie lactat từ một hỗn hợp chiết acid lactic thô với rỉ đƣờng, sữa và các loại rƣợu, thu tinh thể Magie lactat có độ tinh khiết cao [19]. Nghiên cứu có thể áp dụng để tận dụng nguồn phế phẩm để sản xuất một nguyên liệu giá rẻ dùng trong công nghiệp và Y tế.
73
ẾT LUẬN VÀ IẾN NG Ị
Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài, nghiên cứu đã đạt đƣợc một số kết quả sau:
1. Đã lựa chọn một số điều kiện của quá trình nuôi cấy Lactobacillus acidophilus sinh tổng hợp Magnesi lactat quy mô phòng thí nghiệm để nâng cao hiệu suất đạt 72%.
Đã xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính giữa độ OD600 và mật độ tế bào với hệ số tƣơng quan R2
= 0,98.
Đã khảo sát ảnh hƣởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L. acidophilus: nồng độ ionMg2+ từ 0,5% đến 2,0% không có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật và còn làm tăng khả năng sinh acid lactic của vi sinh vật nghiên cứu.
Đã lựa chọn đƣợc phƣơng thức bổ sung dần Magnesi cacbonat sau mỗi 24 giờ để môi trƣờng nuôi cấy duy trì pH = 6,0.
Đã lựa chọn nguồn hydrat carbon thích hợp là glucose với nồng độ 9%, và thời điểm thu sản phẩm là 72 giờ.
2. Đã lựa chọn phƣơng pháp và điều kiện của quá trình kết tinh: cô dịch kết tinh còn 30ml và gãi kết tinh 2 – 5 phút đến khi tạo hỗn dịch đặc, nhiệt độ kết tinh thƣờng 25 – 30oC và thời gian kết tinh là 6 giờ.
3. Đã xác định cấu trúc và kiểm nghiệm Magnesi lactat theo tiêu chuẩn Dƣợc