tổng hợp lên men vi sinh vật
Peter Johannes Marie Baets và các cộng sự (2013) đã sản xuất Magnesi lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh lactic B. coagulans trong môi trƣờng chứa nguồn nguyên liệu thực vật, lá cây Cọ dầu nhiệt đới (Elaeis guineen-sis
và Elaeis oleifera), có chứa 0,5% đến 9,5% carbohydrat và Magnesi hydroxyd để thu đƣợc 9,5% Magnesi lactat [54].
20
Jan Van Krieken và các cộng sự (2007) đã điều chế Magnesi lactat bằng cách sử dụng một trong các hợp chất của Magnesi là Magnesi hydroxyd, Magnesi oxyd, Magnesi carbonat duy trì môi trƣờng lên men các carbohydrat ở pH 5 – 7 với chủng vi khuẩn thích hợp [38].
Jan Van Krieken và các cộng sự (2005) đã kết tinh đƣợc Magnesi lactat rất tinh khiết từ dịch lên men nguồn carbohydrat tƣơng đối thô: sucrose, tinh bột (lỏng), rỉ đƣờng. Sử dụng Magnesi hydroxyd làm tác nhân trung hòa [37].
Ben - Yoseph Eliahu và các cộng sự (1999) sản xuất Magnesi lactat từ vi sinh vật bằng phƣơng pháp lên men đƣờng, điều chỉnh pH về 6,5 bằng cách thêm Magnesi hydroxyd, nhiệt độ 50°C [18].
Aharon Meir Eyal, Rod Fisher (1998) sản xuất Magnesi lactat thông qua việc sinh tổng hợp acid lactic trong quá trình lên men của vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus, loài Lactobacillus delbrueckii, hoặc Lactobacillus acidophilus. Nguyên liệu chính là các carbohydrat cùng với các nguồn dinh dƣỡng phù hợp. Độ pH của dịch lên men thƣờng đƣợc duy trì trên 4,5, tốt nhất khoảng 6,0 - 6,5 bằng các muối Magnesi carbonat, bicarbonat của các kim loại kiềm thổ (Calci hoặc Magnesi) [14].
Kolomaznik và các cộng sự (1995) nghiên cứu sản xuất Magnesi lactat bằng cách lên men vi khuẩn, bổ sung Magnesi hydroxyd, Magnesi oxyd, Magnesi carbonat trong quá trình lên men lactose tại pH 4,5 – 5,03 [42].
Bode Harold Eli và các cộng sự (1969) điều chế Magnesi lactat bằng phƣơng pháp lên men rỉ đƣờng, sữa, mía, mật đƣờng củ cải, hoặc polyme monosaccharide thô khác nhau nhƣ tinh bột, dextrin, cellulose, sucrose và pentosans đã đƣợc thủy phân. Tạo Magnesi lactat thông qua Calci lactat bằng cách thêm Magnesi hydroxyd vào giai đoạn kết thúc quá trình lên men [19].
Ngoài các nghiên cứu về sinh tổng hợp, Magnesi lactat còn đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học dùng làm nguyên liệu trong công nghệ thực phẩm, tổng hợp Magnesi lactat từ acid lactic và Mg(OH)2 [13], [23], [74].
21
Mặc dù Magnesi lactat đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣng hiện tại Việt Nam chƣa có nghiên cứu quy trình sản xuất đã công bố nào liên quan đến sản xuất Magnesi lactat nên đây cũng là lý do mà chúng tôi thực hiện đề tài này.
22
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ P ƢƠNG P ÁP NG IÊN CỨU 2.1. Nguy n vật liệu, thiết ị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng giống: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 dạng đông khô. Nguyên liệu và hóa chất
Bảng 2.1. Các nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc
Glucose Trung Quốc
Sữa bột Việt Nam
Cao nấm men Merck – Đức
(NH4)2SO4 Trung Quốc
KH2PO4 Trung Quốc
MnSO4.H2O Trung Quốc FeSO4.7H2O Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc
MgCO3 Trung Quốc
Nƣớc cất Việt Nam
Bản mỏng silicagel Merck – Đức
NaOH Trung Quốc
NaK(C4H4O6) Trung Quốc H2SO4 98% Trung Quốc Na2S2O3 Trung Quốc
KMnO4 Trung Quốc
Br2 Trung Quốc
Isopropanol Việt Nam
Methanol Việt Nam
23 Môi trƣờng nuôi cấy sử dụng:
Bảng 2.2. Môi trường nhân giống MRS và lên men
Môi trƣờng nhân giống MSR
Th nh phần hối lƣợng Glucose 2,0g Pepton 1,0g Cao thịt 0,5g Cao nấm men 0,4g (NH4)2SO4 0,2g KH2PO4 0,25g MnSO4.H2O 0,001g FeSO4.7H2O 0,001g MgSO4.7H2O 0,03g Nƣớc máy vđ 100ml Điều chỉnh pH = 6,3 – 6,5
Môi trƣờng lên men
Th nh phần hối lƣợng Glucose 2,0g Sữa bột 2,6g Cao nấm men 1,3g (NH4)2SO4 0,2g KH2PO4 0,25g MnSO4.H2O 0,001g FeSO4.7H2O 0,001g MgSO4.7H2O 0,03g Nƣớc máy vđ 100ml Điều chỉnh pH = 6,3 – 6,5 Môi trƣờng MRS đặc: Môi trƣờng MRS lỏng + 2,0g thạch.
Chất chuẩn sử dụng: Viên nén Magnesi B6 của công ty Mekophar, Việt Nam. Số lô: 13003AN, ngày sản xuất 04/07/2013.
Các dung dịch sử dụng: đƣợc pha theo hƣớng dẫn của DĐVN IV:
Dung dịch acid oxalic 10%: Hòa tan 10g acid oxalic trong nƣớc và thêm nƣớc vừa đủ 100 ml.
Dung dịch Schoorl A: Cân chính xác 34,66g CuSO4.5H2O, hòa tan trong nƣớc đã acid hóa bằng 2-3 giọt H2SO4 loãng. Thêm nƣớc vừa đủ 500ml.
Dung dịch Schoorl B: Cân 173g muối kép Natri kali tactrat NaK(C4H4O6) và 50g NaOH, hòa tan trong 300ml H2O, để nguội, thêm H2O vừa đủ 500ml.
24
Dung dịch H2SO4 25%: Đong chính xác 71ml H2SO4 98% pha với chính xác 500ml H2O, làm nguội.
Dung dịch Na2S2O3 0,1N: Cân chính xác 25,0g Na2S2O3 và 0,2g Na2CO3 hòa tan trong nƣớc cất không có CO2, thêm H2O vừa đủ 1000ml.
Dung dịch HCl 0,01M: Pha loãng 2,4 ml axit hydrocloric với nƣớc vừa đủ 100 ml.
2.1.2. Thiết bị sử dụng
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng
Thiết bị, dụng cụ Nguồn gốc, xuất xứ
Nồi hấp ALP, Nhật
Tủ cấy Sanyo, Nhật
Tủ ấm Memmert, Đức
Tủ sấy Daihan, Hàn Quốc
Máy li tâm Hettich, Đức
Bếp cách thủy HHS, Trung Quốc
Tủ lạnh Daewoo, Hàn Quốc
Máy đo pH Eutech instrument pH150 (Anh).
Máy đo quang Hitachi U-1800, Nhật
Máy đo hàm ẩm Ohaus- Mỹ
2.2. Nội ung nghi n ứu
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp Magnesi lactat quy mô phòng thí nghiệm.
Xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 và mật độ tế bào.
Khảo sát ảnh hƣởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L. acidophilus.
25
Khảo sát và lựa chọn phƣơng thức bổ sung Magnesi cacbonat - Bắt đầu quá trình lên men.
- Trong quá trình lên men.
Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy: 5 - 7
Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn hydratcarbon: glucose, lactose, saccarose, maltose.
Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ glucose: 2% - 11% Lựa chọn thời điểm thích hợp thu sản phẩm.
2.2.2. Khảo sát và lựa chọn một số phƣơng pháp và điều kiện kết tinh thu sản phẩm Magnesi lactat.
Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp kết tinh: tự kết tinh, tạo mầm. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh: 0 – 4oC, 25 – 30oC, 37oC. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian kết tinh: 1 giờ, 6 giờ, 18 giờ, 24 giờ,
48 giờ.
Đề xuất quy trình xử lý dịch lên men quy mô phòng thí nghiệm.
2.2.3. Xác định cấu trúc và kiểm nghiệm Magnesi lactat theo tiêu chuẩn Dƣợc Điển Anh 2010.
Xác định cấu trúc hóa học: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phân tử (MS), cộng hƣởng từ proton (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nƣớc.
26
2.3. Phƣơng pháp nghi n ứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống và nuôi cấy
2.3.1.1. Phƣơng pháp nhân giống:
Môi trƣờng nhân giống (bảng 2.2) sau khi đƣợc tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội xuống 40 – 450C cấy chủng L. acidophilus. Ủ trong tủ ấm CO2 5%, ở nhiệt độ 370C. Sau 24 giờ nuôi cấy đƣợc giống cần thiết.
Trƣờng hợp giống đƣợc giữ ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh) lâu ngày thì phải đƣa giống về trạng thái hoạt động bằng cách ủ trong tủ ấm nhiệt độ 370C trong 2 - 3 ngày rồi tiến hành các bƣớc nhƣ trên [6].
2.3.1.2. Phƣơng pháp lên men thu Magnesi lactat:
Chuẩn bị 100ml môi trƣờng lên men (bảng 2.2) với các thành phần và tỉ lệ nghiên cứu vào các bình nón 250ml. Các thành phần yêu cầu tiệt trùng riêng biệt thì pha riêng. Tiệt trùng môi trƣờng ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ khoảng 40 – 450C, trộn lẫn các thành phần tiệt trùng riêng. Sau đó cấy giống vào các bình này trong tủ cấy vô trùng với tỉ lệ giống là 10% [6].
Sau khi cấy giống, để lên men tĩnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C, thỉnh thoảng lắc. Bổ sung MgCO3 ngay thời điểm ban đầu hoặc sau mỗi 24 giờ. Sau 96 giờ, thu lấy dịch lên men để kết tinh Magnesi lactat.
2.3.2. Phương pháp tách chiết Magnesi lactat từ dịch lên men
Dịch lên men đƣợc đun cách thủy ở nhiệt độ 800C trong 20 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Lọc nóng, loại tủa và các thành phần không tan. Bổ sung 2% (kl/tt) than hoạt vào dịch lọc để tẩy màu, đun cách thủy 10 phút sau đó lọc nóng bằng phễu Buchner loại bỏ than hoạt. Cô cách thủy dịch lọc đến còn 30% thể tích. Kết tinh, lọc, thu tinh thể, rửa 2 lần bằng nƣớc cất đã để lạnh. Sản phẩm màu trắng, đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 400
C trong 24 giờ. Cân lƣợng sản phẩm thu đƣợc [19].
27
2.3.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật
2.3.3.1. Phƣơng pháp đếm đếm khuẩn lạc định mật độ tế bào vi sinh vật. Nguyên tắc: Xác định số lƣợng vi sinh vật còn sống có trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc [21].
Tiến hành:
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trƣờng MRS đặc (nêu trong bảng 2.2). Hòa tan các thành phần tan trong nƣớc, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình đựng môi trƣờng ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trƣờng lên các đĩa petri đã đƣợc rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng, để nguội, chờ đông rắn rồi đậy nắp kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nƣớc muối sinh lý, đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 20 phút, để nguội. Lắc đều bình lên men. Dùng pipet hút chính xác 1ml dịch cần định lƣợng vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, sau đó từ ống nghiệm thứ nhất lại hút chính xác 1ml cho vào ống nghiệm thứ tiếp theo. Mẫu tế bào cần đo đem pha loãng mẫu theo dãy thập phân 10-6
đến 10-11. Hút 0,5ml tƣơng ứng ở mỗi nồng độ pha loãng vào mỗi đĩa (lặp lại 3 lần đối với mỗi độ pha loãng) và đổ môi trƣờng dinh dƣỡng tƣơng ứng vào mỗi đĩa (môi trƣờng đã đƣợc khử trùng, để nguội 37oC). Ủ các đĩa này trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37oC. Tiến hành định lƣợng số vi sinh vật trên các mẫu, sau 48 giờ đọc kết quả. Số lƣợng VSV có trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy ban đầu đƣợc tính theo công thức:
28 Trong đó:
X: số vi sinh vật có trong 1 ml mẫu.
An: số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng thứ n. 2.3.3.2. Phƣơng pháp đo độ đục OD định mật độ tế bào vi sinh vật
Nguyên tắc: dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lửng trong qua lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của chúng làm chúng phân tán chùm ánh sáng tới. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập quan hệ tuyến tính giữa chúng. Mật độ vi sinh vật có thể đƣợc đo trực tiếp thông qua máy đo độ đục (máy quang phổ đo ở bƣớc sóng 600nm) [30].
Tiến hành:
- Xác định độ đục OD: Lấy 10ml dịch lên men sau 24 giờ, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Trong trƣờng hợp, dịch lên men có chứa MgCO3, không tan, thêm H2SO4 0,1N để tạo thành dạng muối MgSO4 tan trong nƣớc, không ảnh hƣởng đển độ đục của dịch đem đo. Bỏ dịch lên men thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng nƣớc muối sinh lý. Bổ sung nƣớc muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml trong ống ly tâm. Tiến hành pha loãng mẫu với hệ số pha loãng khác nhau và đo OD600 ứng với các hệ số pha loãng đó.
- Định lƣợng số tế bào vi khuẩn ban đầu trong dịch nuôi cấy tăng sinh sau 24 giờ bằng phƣơng pháp nhƣ mục: 2.3.3.1. đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng đĩa thạch.
- Từ các giá trị OD600 tƣơng ứng và các giá trị mật độ tế bào pha loãng (cách pha loãng nhƣ trong bảng 2.4) tiến hành lập phƣơng trình biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa mật độ tế bào (số tế bào/ml) và độ hấp thu OD600.
29
Bảng 2.4. Các nồng độ pha loãng để xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào Ống thí nghiệm Mẫu trắng 1 2 3 4 5 6 7 8 Mẫu dd (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 NaCl 0.9% 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0
- Xác định mật độ tế bào theo trị số OD600 của các mẫu có mật độ tế bào vi sinh vật tƣơng ứng cần đo đƣợc (pha loãng mẫu cầu đo sao cho trị số OD600
nằm trong khoảng tuyến tính), kết hợp với đồ thị vừa lập cho phép ta xác định mật độ tế bào trong dịch nuôi.
2.3.4. Phương pháp tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat
Nguyên tắc: Dựa trên nồng độ đƣờng tiêu thụ để tính hiệu suất tạo sản phẩm.
C6H12O6 2CH3–CHOH–COOH (CH3–CHOH–COO)2Mg.2H2O
Mglucose = 180 MMagnesi lactat dihydrat = 238
Từ kết quả định lƣợng đƣờng trong mẫu khởi điểm và kết thúc, tra bảng ta đƣợc nồng độ % đƣờng trong 2 mẫu, từ đó tính đƣợc lƣợng đƣờng tiêu thụ.
Dựa trên hiệu suất tiêu thụ đƣờng, tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat theo công thức:
Trong đó:
H: hiệu suất (%).
m: số gam Magnesi lactat/100ml dịch lên men.
a: C% glucose khởi điểm. b: C% glucose kết thúc.
30
2.3.5. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của sản phẩm
Sản phẩm Magenesi lactat đƣợc xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nƣớc bằng cách đo khối lƣợng mất do nƣớc bay hơi.
- Phổ hồng ngoại (IR): phổ IR đƣợc ghi trên máy Shimadzu trong vùng 4000 – 400 cm-1. của Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [4], [10].
- Phổ khối lƣợng (MS): phổ MS đƣợc ghi theo phƣơng pháp ESI (ion âm) trong dung môi Methanol, đƣợc ghi trên máy LCMS – 2010EV (Shimadzu) tại phòng Thí nghiệm Hoá vật liệu - Khoa Hoá học - Trƣờng ĐHKHTN – ĐHQGHN [4], [10].
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR): phổ 1H-NMR đƣợc ghi trong D2O trên máy Brucker Av – 500 MHz, chất chuẩn tetramethylsilan tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dùng D2O làm dung môi [4], [10].
- Xác định công thức muối ngậm nƣớc: xác định khối lƣợng nƣớc mất do bay hơi bề mặt: dùng máy đo hàm ẩm. Cân khoảng 0,5 g bột, cho vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 1050C, theo dõi và đọc kết quả.
Xác định khối lƣợng nƣớc mất do bay hơi phân tử nƣớc đã ngậm: Lấy khoảng 0,5g bột đã làm bay hơi nƣớc bề mặt, cho vào đĩa cân phân tích, đọc kết quả. Sau đó sấy trong tủ sấy ở 125oC trong khoảng 24 giờ đến khi khối lƣợng không đổi, theo dõi và đọc kết quả [25].
Sản phẩm Magnesi L - lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại dạng hydrat C6H10MgO6.nH2O. Tính số phân tử nƣớc ngậm theo công thức sau:
31 Trong đó:
H: Khối lƣợng nƣớc mất do bay hơi
m: Khối lƣợng bột khô sau khi đã bay hơi nƣớc bề mặt. Msp: khối lƣợng phân tử Magnesi lactat
Mnc: Khối lƣợng phân tử của nƣớc
2.3.6. Phương pháp kiểm nghiệm Magnesi lactat
Sản phẩm đã tinh chế đƣợc định tính, định lƣợng và kiểm tra chất lƣợng theo chuyên luận Magnesi lactat trong Dƣợc điển Anh BP 2010 [22] và Dƣợc điển Việt Nam IV [3].
2.3.6.1. Phƣơng pháp định tính các ion lactat và magie
Thử định tính ion lactat: Hòa tan khoảng 20mg chế phẩm trong 5ml nƣớc, thêm 1 ml nƣớc brom và 0,5ml dung dịch acid sulfuric 1M. Đun cách thủy đến khi mất màu, thỉnh thoảng khuấy bằng đũa thủy tinh. Thêm 4g amoni sulfat, trộn đều. Thêm từng giọt theo thành ống nghiệm 0,2ml dung dịch natri nitroprusiat 10% trong acid sulfuric 1M (không trộn) và 1ml amoniac đậm đặc. Để yên 30 phút sẽ có vòng màu lục giữa bề mặt 2 chất lỏng [22].
Thử định tính ion magnesi: Hòa tan 15mg chế phẩm trong 2ml nƣớc. Thêm 1ml dung dịch NH3 6M, tạo tủa trắng. Tủa trắng tan khi thêm 1ml dung dịch amoni clorid. Thêm 1ml dung dịch Na2HPO4 9% có tủa kết tinh trắng [22].
2.3.6.2. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel G.
Dung môi khai triển: Isopropanol - nƣớc - amoniac đậm đặc (85 : 20 : 1).