than bằng kỹ thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch
Với mục đích tạo được kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng nhận biết được protein BclA tự nhiên có trên vỏ bào tử B. anthracis , chúng tôi tiến hành phá vỏ bào tử B. anthracis bằng cách cho bào tử vi khuẩn B. anthracis vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Trải các thành phần bao gồm: Goat anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử lên màng Nitrocellulose, ủ màng ở 37o
C trong khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành lắp các thành phần lên que thử. Kết quả tiến hành thử nghiệm được trình bày ở hình 23.
Hình 23: Kết quả thử nghiệm trên que thử miễn dịch với dịch phá vỏ bào tử.
C: Vạch đối chứng (kiểm tra sự hoạt động của que thử) T1: Kết quả hiện màu với protein tái tổ hợp
Goat anti mouse (C) BclA tái tổ hợp (T1)
Từ kết quả trên cho chúng tôi thấy rằng, bước đầu chúng tôi đã tạo thành công kháng thể đa dòng bắt được kháng nguyên tự nhiên của vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis bằng cách tạo kháng nguyên trên vỏ bào tử (BclA) theo con đường tái tổ hợp. Để khẳng định một lần nữa kết quả trên chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng phát hiện của kháng thể đa dòng với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis theo phương pháp Western blot.
3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng phương pháp Western blot. than bằng phương pháp Western blot.
Sau khi có kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của kháng thể đa dòng với dung dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than tự nhiên trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phản ứng kháng nguyên- kháng thể giữa kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than (BclA tự nhiên) bằng phương pháp western blot. Đây là một bước quan trọng để có thể khẳng định được quá trình gây tạo kháng thể đa dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng bắt cặp được với kháng nguyên tự nhiên từ vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis.
Chúng tôi tiến hành phá vỏ bào từ vi khuẩn B. anthracis bằng cách cho bào tử vi khuẩn B. anthracis vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ
bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Tiếp theo, tiến hành sử lý các mẫu bao gồm mẫu protein BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử bằng cách: mẫu được pha theo tỷ lệ 1:2 với hỗn hợp dye (950μl đệm SDS-reducing và 50μl β – mercaptothanol). Mẫu và marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder được
đun nóng 950C trong 5-10 phút và được đổ vào giếng. Đậy nắp khung và cắm điện, cài đặt máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút. Sau đó protein được chuyển lên màng Nitrocellulose bằng phương pháp điện di chuyển trong đệm Tris-Glycine có 20% Methanol. Sau đó màng được phủ bởi kháng thể sơ cấp (polyclonal anti BclA) và
protein được hiện bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p-nitro blue tetrazolium chloridel 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm TBS pH 9.0. có 5mM MgCl2, khi các băng hiện rõ, phản ứng được làm ngưng bằng đệm TBS có chứa 20mM EDTA.
Hình 24: Kết quả lai chuyển thấm kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể
1: Huyết thanh trước khi gây đáp ứng miễn dịch
2: Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis có trọng lượng khoảng 70kDa 3: Protein BclA tái tổ hợp
4: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder
Kết quả lai chuyển thấm miễn dịch ở hình 24 cho thấy: ở giếng 1 tương ứng với huyết thanh của chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch, không thấy xuất hiện băng
1 2 3 4 6.0kDa 115.5kDa 181kDa 82.2kDa 64.2kDa 48.8kDa 37.1kDa 25.9kDa 19.4kDa 14.8kDa
được gây đáp ứng miễn dịch không có khả năng nhận ra hay phản ứng chéo với protein BclA tái tổ hợp. Từ đó cho phép chúng tôi nhận định rằng trong lô chuột thử nghiệm không bị nhiễm vi khuẩn than trước khi gây đáp ứng miễn dịch.
Mặt khác, kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch ở độ pha loãng 1000 lần có khả năng nhận biết đặc hiệu với băng chứa BclA tái tổ hợp có kích thước vào khoảng 35kDa ( giếng 3). Ngoài ra, kết quả còn cho thấy kháng thể đa dòng có khả năng nhận biết một băng tương tự của dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than có kích thước vào khoảng 70kDa (giếng 2) tương ứng với kháng nguyên BclA tự nhiên (BclA tự nhiên, hay BclA có mặt trong dịch phá vỏ bào tử có trọng lượng phân tử lớn hơn dạng tái tổ hợp do kháng nguyên này vẫn còn bao gồm đầy đủ đoạn 1 vùng giống collagen, vùng này là sự lặp đi lặp lại của bộ GPT - glycine, proline, và threonine). Kết quả thu được cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận rằng:
+ Thứ nhất: Việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công.
+ Thứ hai: Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng bắt cặp với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi khuẩn than.