của các chủng vi khuẩn B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis B. subtilis
trên que thử dạng sắc ký miễn dịch.
Như chúng ta đã biết, thành phần protein BclA có trong vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn là B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis (hình 5) và chủng vi khuẩn không có protein BclA là B. subtilis . Do đó sau khi đã tinh sạch kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Hitrap protein G- Sepharose HP, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ khả năng bắt cặp kháng nguyên kháng thể của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis.
PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors
trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Tiếp theo, trải các thành phần bao gồm: goat anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử của 3 chủng vi khuẩn lên màng Nitrocellulose, ủ màng ở 37oC trong khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành nắp các thành phần lên que thử.
Tiến hành thử nghiệm trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch cho kết quả (Hình 25) như mong đợi.
Hình 25: Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis, B. subtilis .
1: Dịch phá vỏ bào tử B. subtilis 2: Dịch phá vỏ bào tử B. cereus
3: Dịch phá vỏ bào tử B. thuringiensis 4: Dịch phá vỏ bào tử B. anthracis
1 2 3 4
Goat anti mouse (C) BclA tái tổ hợp (T1) Dịch phá vỏ bào tử (T2)
Trên que thử với dịch phá vỏ bào tử của vi khuẩn B. subtilis , cho kết quả âm tính điều đó chứng tỏ rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp không phản ứng chéo với các protein trên vỏ bào tử của B. subtilis. Điều đó phù hợp với những khảo sát rằng, vỏ bào tử vi khuẩn B. subtilis không có chứa thành phần protein BclA trên vỏ bảo tử. Mặt khác, thử nghiệm trên que thử nhanh với các chủng vi khuẩn
B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, chúng tôi đều thu được kết quả phản ứng tốt giữa kháng thể đa dòng với các dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn này. Trên que thử kết quả phản ứng cho một màu đỏ nâu, điều đó một lần nữa có thể khẳng định chúng tôi đã chế tạo thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng phản ứng lại được với protein BclA tự nhiên. Trên cơ sở đó, từ việc sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trên vỏ của bào tử vi khuẩn than, chúng ta có thể tiến hành những nghiên cứu tiếp theo để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng lại BclA trên vỏ bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis
KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN:
Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
1. Bằng phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch, đã sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp.
2. Đã tinh sạch được kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP.
3. Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có phản ứng với protein BclA tự nhiên có mặt trong dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than.
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Chúng tôi đã thành công trong việc tạo ra kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp và kháng thể này có phản ứng tích cực với protein BclA tự nhiên. Do đó, trong hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành sử dụng protein BclA tái tổ hợp làm kháng nguyên để tạo kháng thể đơn dòng kháng lại BclA của vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt
1. Đỗ Ngọc Liên (2004), Thực hành Hóa sinh miễn dịch, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Mùi (2001), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
B. Tiếng Anh
3. Abrami, L. N. Reig, and F. G. van der Goot (2005), “Anthrax toxin: the long and winding road that leads to the kill”. Trends Microbiol,13:72-78
4. Antibody purification, Handbooks from Amersham Biosciences
5. Aronson, A. I., and P. Fitz-James (1976), “Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat”, Bacteriol. Rev, 40:360-402.
6. Burns R. (2004), Immunochemical protocols, Methods in molecular biology, vol. 295, 3rd ed, Humana Press.
7. Charlton, S., A. J. Moir, L. Baillie, and A. Moir (1999), “Characterization of the exosporium of Bacillus cereus”, J. Appl. Microbiol, 87:241-245.
8. Christopher Steichen, Ping Chen, John F. Kearney, and Charles L. Turnbough, Jr. (2002), Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of the Bacillus anthracis Exosporium, Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama 3529.
9. Cote, C. K., C. A. Rossi, A. S. Kang, P. R. Morrow, J. S. Lee, and S. L. Welkos (2005), “The detection of protective antigen (PA) associated with spores of Bacillus anthracis and the effects of anti-PA antibodies on spore germination and macrophage interactions”, Microb. Pathog, 38:209-225.
10. Edwards, K. A., H. A. Clancy, and A. J. Baeumner (2006), “Bacillus anthracis: toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods”, Anal. Bioanal. Chem. , 384:73-84.
12. Petosa C., Collier R. J., Klimpel K. R., Leppla S. H., Liddington R. C. (1997), "Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen.", Nature, 385 (6619): 833–
838.
13. Rapid Lateral Flow Test Strips, Handbooks from
www.millipore.com/diagnostics.
14. Redmond C., L. W. Baillie, S. Hibbs, A. J. Moir, and A. Moir (2004), “Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis”, Microbiol.,
150:355-363.
15. Ronald E. (2003), Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc.
16. Sylvestre P., E. Couture-Tosi, and M. Mock (2002), “A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium”, Mol. Microbiol, 45:169-178.
17. Sylvie Salamitou, Ignacio Garcia-Verdugo, David J. S. Hulmes, Richard Chaby and Anita Lewit-Bentley (2004), The Crystal Structure of the Bacillus anthracis Spore Surface Protein BclA Shows Remarkable Similarity to Mammalian Proteins, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.
18. Tijssen (1985), Practice and theory of enzyme immunoassays, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology 4th, 15: 242 - 246.
19. Todd S. J., A. J. Moir, M. J. Johnson, and A. Moir (2003), “Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium”, J. Bacteriol.,
185:3373-3378.
20. Turnbough, C. L., Jr. (2003), “Discovery of phage display peptide ligands for species-specific detection of Bacillus spores”, J. Microbiol. Methods, 53:263-271.
21. Van Weemen BK, Schuurs AH (1971), "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates.". FEBS Letters, 15 (3): 232–6
22. Welkos S., S. Little, A. Friedlander, D. Fritz, and P. Fellows.(2001), “The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores”, Microbiology, 147:1677-1685.