a. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (Hình 13) hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế.
b. Cách thực hiện
- Phân đoạn protein được pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích (mẫu X) (n=1, 2).
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1,
lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.
- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),... tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
c. Cách tính kết quả
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang OD595
- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X.
P = X*n
Để tính toán hàm lượng protein trong 1g mẫu cân: Protein (mg/g) = P x V/m
V = thể tích dung dịch trích ly, ml m = khối lượng mẫu, g.