- Kháng nguyên: Kháng nguyên là protein BclA tái tổ hợp, được pha vào trong đệm
PBS pH 7.4 có nồng độ 0.5mg/ml.
- Chuột : Chia làm 2 lô, mỗi lô bao gồm 6 con
Lô thí nghiệm: Được sử dụng để gây miễn dịch. Lô đối chứng: Không gây miễn dịch.
- Gây miễn dịch trên Chuột:
+ Trộn đều kháng nguyên với tá dược Freund’s đầy đủ theo tỷ lệ 1:1. + Sử dụng kháng nguyên với hàm lượng 50-100 g/lần tiêm.
+ Chuột được gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da bụng của chuột, tiêm thành nhiều điểm khác nhau.
+ Sau 2-3 tuần tiêm nhắc lại để tạo được hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao nhất. Pha kháng nguyên với tá dược Freund’s không đầy đủ theo tỷ lệ 1:1 và tiêm nhắc lại như với lần tiêm đầu tiên.
Thu huyết thanh trước mỗi lần tiêm để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch. Cho chất chống đông máu vào ống tiêm (3.8% Na citrate theo tỷ lên với mẫu máu là 1:10), thu 1-3ml máu dùng để kiểm tra.
Chích kim tiêm vào động mạch trung tâm ở cổ chuột hoặc cắt đuôi chuột thu máu.
2.2.2. Kỹ thuật ELISA
a. Nguyên tắc:
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh học để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
b. Các bước tiến hành:
- Phủ kháng nguyên lên đĩa 96 giếng ủ 60 phút. - Rửa đĩa bằng đệm rửa.
- Khoá các gốc tự do trên đĩa bằng đệm Blocking, ủ 30 phút. - Rửa lại đĩa 96 bằng đệm rửa.
- Chuẩn bị kháng thể chuẩn và mẫu kháng thể kháng IgG chuột, hoà loãng ở các nồng độ khác nhau.
- Hút chuyển 100 l dịch mẫu và dịch chuẩn cho vào mỗi giếng. - Ủ đĩa 60 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa để loại bỏ hoá chất thừa bằng đệm rửa.
- Pha loãng kháng thể “Anti-Mouse IgG (Fab specific)-Peroxidase antibody
- Hút chuyển 100 l kháng thể cộng hợp enzyme ở trên cho vào mỗi giếng. Ủ bản giếng ở nhiệt độ phòng trong vòng 1-2 giờ.
- Rửa hoá chất thừa sau khi ủ bằng đệm rửa.
- Bổ sung 100 l cơ chất “TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)” của enzyme theo tỷ lệ vào mỗi giếng.
- Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng 5 – 30 phút.
- Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 100 l H2SO4 2M vào mỗi giếng. - Đọc kết quả trên máy đọc ELISA tại bước sóng 450nm.