trên chuột.
Nhằm đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis, chúng tôi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng BclA tái tổ hợp với quy trình như sau: kháng nguyên BclA sau khi được tinh sạch bằng cột Talon (Niken) được hòa với đệm PBS và tá dược Freund’s (toàn phần và không toàn phần) rồi tiêm dưới da bụng chuột. Cũng như nhiều protein khác, bản thân protein BclA là kháng nguyên yếu, không đủ gây đáp ứng miễn dịch mạnh, vì vậy phải được bổ sung tá dược. Khi trộn với kháng nguyên, tá dược sẽ làm kháng nguyên bị phân giải chậm hơn, phóng thích dần dần vào cơ thể, làm
Goat anti mouse (C)
T2
1 2
complete adjuvant) là loại tá dược được dùng phố biến nhất, thành phần chủ yếu gồm huyền dịch dầu khoáng trong nước và xác vi khuẩn Mycobacteria. Huyền dịch dầu khoáng tạo ra sự lan tỏa định khu và kéo dài của kháng nguyên trong cơ thể gây miễn dịch, xác vi khuẩn Mycobacteria có tác dụng hấp dẫn các tế bào của hệ miễn dịch tới vị trí tiêm để làm tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch. Tá dược toàn phần chỉ dùng cho lần tiêm kháng nguyên đầu tiên, với các mũi tiêm nhắc lại sẽ sử dụng tá dược không toàn phần (có thành phần tương tự như tá dược toàn phần nhưng không có xác vi khuẩn Mycobacteria). Việc gây kháng thể ở chuột được thực hiện với hai lần tiêm, trong đó lần tiêm đầu tiên chúng tôi sử dụng tá dược toàn phần, lần tiêm nhắc lại chúng tôi sử dụng với tá dược không toàn phần. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 2 tuần. Sau lần tiêm thứ hai 2 tuần chúng tôi tiến hành thu máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể có trong huyết thanh bằng kỹ thuật lai miễn dịch hoặc theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch.
Thu nhận kháng huyết thanh từ lô chuột gồm 06 con được gây miễn dịch bằng BclA và kiểm tra hoạt độ của kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA theo sơ đồ sau:
Hình 17: Biểu đồ Elisa về quá trình gây đáp ứng miễn dịch
Kết quả ở hình 17 cho thấy, lượng IgG của chuột tăng dần theo các tuần gây đáp ứng miễn dịch. Đặc biệt, sau khi tiêm nhắc lại với hỗn hợp tá dược không đầy đủ và kháng nguyên BclA vào tuần thứ 2 thì lượng IgG tăng nhanh và ổn định vào tuần thứ 4 và tuần thứ 5. Điều đó chứng tỏ lô chuột được gây đáp ứng miễn dịch đã có phản ứng tích cực với kháng nguyên đưa vào và từ biểu đồ Elisa cũng cho chúng tôi biết thời điểm tiến hành thu máu tổng số của chuột được gây đáp ứng miễn dịch.
Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành cộng hợp dung dịch huyết thanh của chuột theo các tuần theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch với dung dịch hạt nano vàng có kích thước hạt là 40nm với OD 15, nhằm kiểm tra khả năng sinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trong quá trình gây đáp ứng miễn dịch.
Bằng phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch (Hinh18) cho thấy kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch và cộng hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein BclA tái tổ hợp với nồng độ 0.3mg/ml và mật độ trải lên màng là 0,1μl/1mm.
Hình 18: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng BclA
Vị trí C: Trải kháng thể đa dòng Goat anti mouse Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp
1: Huyết thanh thu tuần 1 2: Huyết thanh thu tuần 2 3: Huyết thanh thu tuần 3 4: Huyết thanh thu tuần 4
Kết quả trên cho thấy, trong dịch huyết thanh của chuột thấy có xuất hiện kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp được biểu hiện bằng sự hiện vạch mầu hồng tại vị trí T. Tại vị trí C chúng tôi trải kháng thể đa dòng của dê kháng lại IgG của chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích kiểm tra sự hoạt động của dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano 40nm. Tại que thử nhứ nhất, chúng ta thấy xuất hiện mầu hồng nhạt tại vị trí T cho ta thấy sau khi tiêm kháng nguyên vào lô chuột gây đáp ứng miễn dịch thì ngay tuần thứ nhất chuột đã có phản ứng đáp ứng miễn dịch
1 2 3 4
Goat anti mouse (C) BclA (T)
với kháng nguyên lạ khi tiêm vào dưới da chuột. Tại que thử thứ 2 vào tuần thứ 2 của quá trình gây đáp ứng miễn dịch đã có sự chững lại về lượng kháng thể sinh ra, bằng chứng của của kết luận trên là cường độ màu chỉ thị trên que ở vị trí T hầu như chênh rất ít so với tuần thứ nhất. Tại que thử thứ 3, tại thời điểm này chúng tôi tiến hành tiêm nhắc lại với lô chuột thí nghiệm. Tại que thử này đã thấy rõ sự khác nhau về màu sắc kết quả tại vị trí T với các que thử thứ nhất và thứ 2, cho ta thấy rằng quá trình tiêm nhắc lại đã cho kết quả tốt về đáp ứng miễn dịch với chuột. Ở que thử số 4, qua kết quả chỉ thị màu tại vị trí T, chúng tôi thấy rằng lượng kháng thể có tăng lên nhưng không nhiều. Do đó, chúng tôi tiến hành thu máu lô chuột gây đáp ứng miễn dịch, tiến hành thu huyết thanh chuột và tinh sạch kháng thể để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thay màng cộng hợp có chứa kháng thể kháng protein BclA tái tổ hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 vào que thử multi các loại thuốc gây nghiện là THC, Morphine để kiểm tra đánh giá khả năng phản ứng chéo và khả năng phong bế (block) các hạt vàng của dung dịch kháng thể kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano.
Goat anti mouse (C) BSA conjugated THC (T1) BSA conjugated Morphine (T2)
Kết quả (Hình 19) thu được cho phép kết luận rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA không phản ứng chéo với các protein khác (ở đây là BSA – Bovine serum albumin). Mặt khác, trên que thử tại hai vạch T1 và T2 không xuất hiện vạch màu hồng cũng đồng nghĩa chứng tỏ trong dung dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng đã được block hoàn toàn các liên kết làm cho hạt vàng không còn khả năng phản ứng với các protein nào khác.
Từ đó cho phép chúng tôi kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công
3.4. Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp
Tuy đã thu được huyết thanh có chứa chủ yếu là kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với Protein BclA tái tổ hợp, nhưng thực tế trong huyết thanh vẫn còn rất nhiều các protein không mong muốn khác. Vì vậy, chúng tôi tiến hành sử dụng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP (hãng GE Healthcare) để loại các protein không mong muốn, nhằm thu được kháng thể IgG kháng Protein BclA tinh sạch.
Phương pháp này dựa vào khả năng liên kết rất đặc hiệu của protein G (là một immunoglobulin của thành tế bào vi khuẩn Streptococcus sp. với vùng Fc của kháng thể IgG chuột), từ đó chúng tôi dễ dàng loại bỏ được các protein không phải là IgG (không có khả năng gắn đặc hiệu) ra khỏi huyết thanh.
Cột HiTrap™ Protein G HP (1x5ml) được cân bằng với đệm rửa cột sodium phosphate 20 mM, pH 7.0. Dung dịch huyết thanh sau khi điều chỉnh pH về pH 7.0 được đưa lên cột với tốc độ là 1ml/phút. Rửa cột bằng đệm sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 để loại các protein không đặc hiệu với cột với thể tích đệm rửa bằng 5 lần thể tích cột. Kết quả (Hình 20) cho thấy đã rửa một lượng lớn các protein không gắn với cột Protein G-Sepharose ra khỏi cột.
Hình 20: Đồ thị rửa cột HiTrap™ Protein G HP bằng sodium phosphate 20 mM, pH 7.0.
Sau đó, chúng tôi tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đặc hiệu với cột protein G- Sepharose) bằng đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7. Các phân đoạn rửa chiết kháng thể nhanh chóng được trung hòa về pH 7.0 bằng bằng cách bổ sung 200 μl thể tích đệm Tris-HCl 1 M, pH 9.0 trên 1ml phân đoạn, nhằm tránh cho kháng thể bị biến tính và tiến hành xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford khi đo độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Kết quả thu được ở Hình 21 cho thấy các phân đoạn cũng chứa các protein (protein không hấp phụ) nhưng với một lượng nhỏ, trong khi đó phần dịch rửa chiết cho một đỉnh protein rất rõ rệt.
Protein (A280)
Protein (A280)
Để khẳng định độ tinh sạch của kháng thể thu được, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra phân đoạn protein gắn đặc hiệu thu được từ cột protein G-Sepharose bằng kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE 12.5%. Kết quả (Hình 22) cho thấy đỉnh protein mà chúng tôi thu được (phân đoạn được rửa chiết bằng đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7) có hai băng protein duy nhất với khối lượng phân tử lần lượt là 53kDa và 25kDa, tương ứng với khối lượng của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kháng thể IgG. Kết quả này chứng tỏ kháng thể thu được là tinh sạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 22: Kết quả điện di tinh sạch kháng thể đa dòng kháng protein BclA
1: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder
2: Phân đoạn tinh sạch kháng thể đa dòng
Chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể vừa tinh sạch bằng phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford. Kết quả nồng độ kháng thể chúng tôi thu được là 1.3mg/ml. 53kDa 25kDa 1 2 6.0kDa 115.5kDa 181kDa 82.2kDa 64.2kDa 48.8kDa 37.1kDa 25.9kDa 19.4kDa 14.8kDa