DềNG KHÁNG FSH
Sau khi cú tế bào lai, việc tạo dũng (từ một tế bào ban đầu) và chọn dũng cần được thực hiện. Chỉ khi tạo và chọn dũng thành cụng thỡ chỳng ta mới cú dũng tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng mong muốn. Vỡ thế, sau khi kiểm tra khả năng sinh khỏng thể khỏng FSH của cỏc giếng cú tế bào lai bằng phương phỏp ELISA, chỳng tụi chọn được một giếng cú giỏ trị OD cao nhất (giếng B3/đĩa 1/tế bào Sp2/0, OD = 2,450) để tiến hành tỏch dũng.
Quỏ trỡnh tỏch dũng được thực hiện bằng phương phỏp pha loóng tới hạn sao cho cú khụng quỏ 1 tế bào/giếng. Mục tiờu sau cựng là tạo được dũng tế bào lai khỏe mạnh, sinh được nhiều khỏng thể mong muốn với chất lượng cao.
Quy trỡnh tỏch dũng (cloning) là một bước vụ cựng quan trọng trong quy trỡnh sản xuất khỏng thể đơn dũng vỡ chỉ khi tỏch dũng thành cụng thỡ mới đảm bảo khỏng thể sinh ra là khỏng thể đơn dũng. Đõy là bước nghiờn
cứu quan trọng nhất trong quỏ trỡnh tạo khỏng thể đơn dũng do tế bào lai rất nhạy cảm đặc biệt là khi thay đổi điều kiện nuụi cấy. Vỡ vậy, để đảm bảo thành cụng khi tỏch dũng chỳng tụi đặt điều kiện vụ trựng lờn hàng đầu, thao tỏc nhẹ nhàng, cẩn thận, khộo lộo, thực hiện thớ nghiệm nhiều lần.
Quy trỡnh tỏch dũng được thực hiện trờn 3 đĩa Corning 96 giếng. Việc tỏch dũng thành cụng là khi mỗi giếng chỉ cú một tế bào. Sau thời gian nuụi cấy, 1 tế bào đú sẽ phỏt triển thành 1 cụm tế bào duy nhất (1 clone). Những tế bào lai chất lượng tốt, khả năng sinh sản nhanh thỡ hỡnh thành cụm tế bào to (clone tế bào) cũn nếu tế bào kộm phỏt triển thỡ cụm tế bào hỡnh thành nhỏ hoặc khụng phỏt triển lờn được thành cụm tế bào.
Hỡnh 4.4. Cỏc cụm tế bào lai (clone tế bào) đang phỏt triển,
độ phúng đại 10ì20
Với nhận định như trờn, chỳng tụi đó kết hợp phương phỏp pha loóng tới hạn kết hợp với việc theo dừi hàng ngày sự phỏt triển của cỏc dũng tế bào để thống kờ và chọn thời điểm thớch hợp cho việc thu nhận dịch nổi nhằm kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể đơn dũng khỏng FSH mong muốn. Kết quả nghiờn cứu của quỏ trỡnh này được chỳng tụi thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Tổng hợp kết quả tỏch dũng để chọn dũng tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng khỏng FSH
Số clone/giếng
Đĩa thớ nghiệm 0 clone/giếng 1 clone/giếng ≥ 2 clone/giếng
Đĩa 1 27/96 50/96 19/96
Đĩa 2 23/96 56/96 17/96
Đĩa 3 21/96 55/96 20/96
Tổng số 71/288 161/288 56/288
Hiệu quả 24,65% 55,90% 19,44%
Kết quả bảng 4.3 cho thấy:
• Đĩa 1 cú 50/96 giếng cú 1 clone/giếng đạt hiệu quả tỏch dũng là 52,08%.
• Đĩa 2 cú 56/96 giếng cú 1 clone/giếng đạt hiệu quả tỏch dũng là 58,33%.
• Đĩa 3 cú 55/96 giếng cú 1 clone/giếng đạt hiệu quả tỏch dũng là 57,29%. Như vậy, trong tổng số 288 giếng ở 3 đĩa thỡ cú 161 giếng cú mật độ tế bào là 1 clone/giếng, đạt hiệu quả tỏch dũng là 55,90%. Hiệu quả tỏch dũng như vậy là tương đối cao và cũng phự hợp với cỏc nghiờn cứu trước đõy của chỳng tụi.
Cỏc giếng cú 1 clone tế bào được tiếp tục nuụi cấy trong khoảng thời gian 2 tuần, sau đú thu dịch nổi và sử dụng phương phỏp ELISA để kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng đặc hiệu FSH trong dịch nổi của cỏc giếng cú 1 clone tế bào/giếng sau khi tỏch dũng. Sau phản ứng ELISA, với 161 giếng cú 1 clone tế bào thỡ chỳng tụi chỉ thu được 32 giếng cú dịch nổi cú phản ứng dương tớnh với khỏng nguyờn FSH.
Như vậy chỉ cú 32 clone tế bào sản xuất khỏng thể khỏng lại FSH. Đõy chớnh là khỏng thể đơn dũng (01 clone tế bào) mà chỳng ta mong muốn. Kết quả tỏch dũng với 32 giếng cú phản ứng dương tớnh cho thấy sự cú mặt của khỏng thể khỏng FSH được thể hiện ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Giỏ trị OD của dịch nổi cỏc giếng cú 1 dũng tế bào dương tớnh với khỏng nguyờn FSH (32/161/288)
(Mỗi giếng được kiểm tra ELISA với độ lặp lại là 3 lần)
STT Giếng Đĩa Giỏ trị OD OD tbỡnh
1 A3 1 0,625 0,651 1 A3 1 2 A9 1 0,803 0,845 2 A9 1 3 B2 1 1,751 1,756 3 B2 1 4 B5 1 2,398 2,469 4 B5 1 5 B7 1 0,543 0,575 5 B7 1 6 E2 1 1,607 1,650 6 E2 1 7 E7 1 2,508 2,517 7 E7 1 8 E8 1 0,892 0,906 8 E8 1 9 F4 1 1,246 1,251 9 F4 1 10 F9 1 1,521 1,532 10 F9 1 11 G2 1 0,743 0,743 11 G2 1 12 C1 1 1,152 1,251 12 C1 1 13 C6 2 0,789 0,694 13 C6 2 14 E1 2 1,843 1,792 14 E1 2 15 E6 2 1,597 1,605 15 E6 2 16 E9 2 1,307 1,278 16 E9 2 17 F1 2 2,389 2,387 17 F1 2 18 F2 2 1,365 1,438 18 F2 2 19 G9 2 1,092 1,126 19 G9 2 20 G12 2 0,536 0,654 20 G12 2 21 H1 2 1,059 1,078 21 H1 2 22 H9 2 0,645 0,589 22 H9 2 23 A1 3 1,973 1,852 23 A1 3 24 A4 3 0,807 0,791 24 A4 3 25 A10 3 2,735 2,689 25 A10 3 26 B3 3 0,845 0,821 26 B3 3 27 C5 3 1,843 1,804 27 C5 3 28 D2 3 2,591 2,557 28 D2 3 29 E3 3 0,869 0,876 29 E3 3 30 E10 3 1,032 1,089 30 E10 3 31 F6 3 0,831 0,898 31 F6 3 32 F10 3 0,794 0,754 32 F10 3 ĐC (+) 2,441 2,4512 ĐC (+) ĐC (-) 0,482 0,437 ĐC (-)
Ghi chỳ: ĐC (+) là huyết thanh của chuột 3.1; ĐC (-) là BSA
Kết quả bảng 4.4 cho thấy:
của giếng đối chứng õm.
•Trong 32 giếng dương tớnh đú, cỏc giếng khỏc nhau cú giỏ trị OD khỏc nhau. Điều này chứng tỏ mỗi dũng tế bào khỏc nhau thỡ khả năng sinh khỏng thể cũng khỏc nhau.
Vỡ vậy cú thể thấy cỏc giếng cú tế bào lai sinh khỏng thể cú chất lượng cao phụ thuộc nhiều vào dũng tế bào lympho B cú đỏp ứng miễn dịch tốt với khỏng nguyờn hay khụng và dũng tế bào Myeloma (qua thực nghiệm đó chứng minh dũng tế bào Sp2/0 tốt hơn dũng P3X). Như vậy, dũng tế bào lympho B cú đỏp ứng miễn dịch tốt lai với dũng tế bào Sp2/0 sẽ cho ra cỏc dũng tế bào lai sinh khỏng thể cú chất lượng cao.
Bước tiếp theo chỳng tụi tiến hành lựa chọn và nhõn lờn cỏc dũng tế bào lai sinh khỏng thể chất lượng cao để từ đú thu lượng lớn khỏng thể mong muốn. Từ kết quả bảng 4.4 chỳng tụi chọn ra 5 dũng tế bào sinh khỏng thể đơn dũng khỏng đặc hiệu FSH tốt nhất tương ứng với 5 giếng cú giỏ trị OD cao nhất là:
Giếng B5 đĩa 1 cú giỏ trị OD = 2,431 được đặt tờn là dũng FSH – 1.
Giếng E7 đĩa 1 cú giỏ trị OD = 2,507 được đặt tờn là dũng FSH – 2.
Giếng F1 đĩa 2 cú giỏ trị OD = 2,416 được đặt tờn là dũng FSH – 3.
Giếng A10 đĩa 3 cú giỏ trị OD = 2,725 được đặt tờn là dũng FSH – 4.
Giếng D2 đĩa 3 cú giỏ trị OD = 2,549 được đặt tờn là dũng FSH – 5. Với 05 dũng tế bào lai đó chọn lọc FSH – 1,2,3,4,5, chỳng tụi tiến hành nhõn nuụi in vitro để cú số lượng lớn tế bào. Để quỏ trỡnh nhõn nuụi đạt kết quả tốt, từ 05 dũng tế bào được chọn chỳng tụi đưa vào 5 chai nuụi cấy sao cho đạt nồng độ 1x105 tế bào/ml. Cỏc chai nuụi cấy được bổ sung mụi trường thớch hợp cho cỏc tế bào lai phỏt triển tốt và nuụi trong tủ ấm 370C, 5%CO2. Mụi trường nuụi cấy chỳng tụi sử dụng gồm cỏc thành phần: DMEM bổ sung FBS 10%.