3.1.1 Động vật thớ nghiệm.
Chuột nhắt trắng dũng BALB/c được nuụi trong điều kiện tiờu chuẩn ở khu chăn nuụi của Viện cụng nghệ sinh học.
3.1.2 Dũng tế bào ung thư tủy (Myeloma).
Dũng Sp2/0- Ag14 (gọi tắt là Sp2/0) và dũng P3X-Ag18 (gọi tắt là P3X) nhận từ ngõn hàng tế bào ATCC của Hoa Kỳ (American Type Culture Collection).
3.1.3 Thiết bị thớ nghiệm.
- Tủ nuụi tế bào (Sanyo, Nhật) cú điều hũa nhiệt độ và CO2 tự động - Tủ cấy vụ trựng sử dụng đốn cực tớm và màng lọc 0,25àm (Microflow, Anh).
- Chai lọ nuụi cấy, pipet cỏc loại của Costar và Corning.
- Kớnh hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật) với độ phúng đại 5 – 20 x 20. - Buồng đếm tế bào phản quang (Fisher, Hoa Kỳ).
- Mỏy đo ELISA (Thermo labsystem, Đức). - Mỏy li tõm lạnh (Hermje, Đức).
- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sõu cỏc loại.
- Bỡnh nitơ lỏng để cất giữ tế bào (Gold Eagle, Trung Quốc).
3.1.4 Húa chất thớ nghiệm.
Mụi trường nuụi cấy cỏc loại (GIBCO, Hoa Kỳ)
- RPMI 1640.
- FBS (Fetal Bovine Serum).
- HAT (Hypoxanthine aminopterin thymidine) medium. - HT (Hypoxanthine thymidine) medium.
Húa chất thớ nghiệm.
- PEG (Polyethylene glycol – Sigma, Hoa Kỳ).
- FCA (Freund Complex Adjuvant – Sigma, Hoa Kỳ). - FIA (Freund Incomplex Adjuvant – Sigma, Hoa Kỳ).
Cỏc húa chất thụng thường khỏc được mua từ cỏc hóng Sigma (Hoa Kỳ), Fisher (Hoa Kỳ), Merck (Đức), Trung Quốc v.v.
Khỏng nguyờn FSH mua từ hóng CALBIOTECH (Hoa Kỳ).
3.1.5. Thời gian và địa điểm nghiờn cứu.
Thời gian từ 01/01/2010 đến 15/05/2010 tại Tổ thử nghiệm sinh học – Viện Cụng nghệ sinh học, Viện Khoa học cụng nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
3.2. NỘI DUNG NGHIấN CỨU
- Nghiờn cứu và tỡm điều kiện tối ưu để gõy miễn dịch hiệu quả trờn chuột BALB/c bằng FSH.
- Nhõn nuụi và phỏt triển tế bào myeloma dũng Sp2/0 và P3x – Ag14 để sử dụng cho quỏ trỡnh lai với tế bào lympho B.
- Nghiờn cứu và xỏc lập quy trỡnh lai tạo dũng tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng khỏng FSH.
- Nghiờn cứu điều kiện để tỏch dũng hiệu quả để thu được 1- 2 dũng tế bào lai sản sinh hiệu quả khỏng thể đơn dũng khỏng FSH.
- Kiểm tra một số đặc tớnh quan trọng của khỏng thể đơn dũng thu được như độ đặc hiệu, hiệu giỏ khỏng thể v.v.
Nguyờn tắc sản xuất khỏng thể đơn dũng
Phải tạo ra được dũng tế bào vừa cú khă năng sinh khỏng thể vừa cú khả năng sinh sản vụ hạn. Để cú được dũng tế bào này người ta lai tế bào ung thư tủy myeloma với tế bào sinh khỏng thể cụ thể là tế bào lympho B.
Cỏc bước tiến hành
* Tạo cỏc tế bào sinh khỏng thể bằng cỏch tiờm khỏng nguyờn để gõy miễn dịch cho chuột. Chuột đó cú đỏp ứng miễn dịch được giết và thu lấy lỏch, hạch để nhận tế bào lympho B.
* Tạo cỏc tế bào lai: Tế bào lympho B đó được hoạt húa sinh khỏng thể được trộn với tế bào Myeloma với tỷ lệ thớch hợp rồi bổ sung thờm yếu tố thỳc đẩy dung hợp PEG (Polyethylen glycol) để tạo tế bào lai.
* Nuụi cấy và chọn lọc tế bào lai: chọn lọc tế bào lai bằng cỏch nuụi cấy trong mụi trường chọn lọc HAT (Hyposanthine Aminopterin Thymidine) và HT (Hyposanthine Thymidine). Chỉ cú tế bào lai tồn tại được và phỏt triển trong mụi trường này, chỳng sinh trưởng nhanh và sản xuất khỏng thể.
* Chọn lọc và tạo dũng tế bào lai sản xuất khỏng thể: Cỏc tế bào lai được nuụi dưỡng trong mụi trường HAT và HT sẽ phỏt triển, sản xuất khỏng thể. Tuy nhiờn đõy vẫn là khỏng thể đa dũng vỡ chỳng được sản sinh từ nhiều dũng tế bào. Do vậy, cần phải sàng lọc, chọn lọc ra dũng tế bào lai cú khả năng sinh khỏng thể cú tớnh đặc hiệu cao.
3.3.1. Gõy miễn dịch cho chuột
Theo phương phỏp của Milstein và Kohler đưa ra năm 1975, cú cải tiến (J.Eryl Liddell và A.Cryer, 2002) [17].
Trộn khỏng nguyờn FSH với một lượng cựng thể tớch của tỏ dược FAC cú tỏc dụng làm tăng hoạt tớnh khỏng nguyờn và kớch thớch hệ thống miễn dịch. Lượng khỏng nguyờn FSH được pha chế ở nồng độ sao cho thể tớch tiờm cho mỗi chuột mỗi lần là 0,2ml.
Ban đầu chuột cỏi BALB/c (6 tuần tuổi) được tiờm dưới da ở 4 vị trớ dọc theo lưng. Chuột được tiờm nhắc lại vào dưới da bụng với cựng một lượng khỏng nguyờn trộn với cựng thể tớch FIA để cú nồng độ tiờm cho mỗi chuột trờn là 0,2ml vào tuần thứ 2 và thứ 4 sau lần tiờm thứ nhất. Cỏc mẫu mỏu được lấy từ tĩnh mạch đuụi hoặc hốc mắt, tỏch huyết thanh để theo dừi hỡnh thành khỏng thể bằng ELISA. Chuột được tiờm lần cuối cựng với một lượng khỏng nguyờn FSH trong 0,1ml dung dịch nước sinh lý khụng trộn với tỏ dược vào tĩnh mạch đuụi lỳc 3- 4 ngày trước khi lấy tế bào lỏch dung hợp với tế bào myeloma.
3.3.2. Phương phỏp lấy đại thực bào
Theo phương phỏp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha, 2000) [19].
Giết chuột, khử trựng chuột trong cồn 70o
Tiờm vào xoang bụng 3ml dung dịch PBS
Dựng bơm tiờm hỳt dung dịch trong xoang bụng ra, đưa vào ống ly tõm. Lặp lại như trờn 3 lần. Dịch hỳt ra từ xoang bụng cú chứa tế bào được kiểm tra dưới kớnh hiển vi. Cho dịch tế bào ly tõm ở tốc độ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt.
Sau ly tõm, hỳt bỏ dịch nổi, hũa lại cặn tế bào với 10ml dung dịch PBS.
Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cựng cặn tế bào được hũa trong 1ml DMEM cú FBS 10%.
Đếm tế bào, pha điều chỉnh sao cho dịch tế bào cú mật độ cần thiết là 103 tế bào/ml, trong mụi trường DMEB 10% FBS.
3.3.3. Phương phỏp đếm tế bào
a. Chuẩn bị Trypan blue 0,4% - Trypan blue: 0,1g
- Dunh dịch sinh lý: 25ml - Màng lọc Millipore: 0,45àl
Lấy 25ml NaCl 0,85% hũa tan 0,1g Trypan blue, cho dung dịch qua màng lọc Millipore được Trypan blue o,4%.
b. Đếm tế bào
Dung dịch tế bào được ly tõm, hỳt hết dịch nổi hũa cặn vào 1ml dung dịch mụi trường.
Dựng pipet hỳt 100àl dung dịch tế bào với 100àl Trypan blue. Cỏc tế bào chết cú màu xanh, tế bào sống khụng bắt màu. Đưa dung dịch tế bào đó trộn với Trypan blue vào buồng đếm. Trừ những tế bào nằm trờn 2 cạnh của ụ vuụng, đếm tế bào sống cú trong 8 ụ.
Tớnh tế bào trung bỡnh của 8 ụ sẽ được số tế bào trung bỡnh trong 1 ụ. Số tế bào được tớnh theo WHO:
N = m x tb x V x 104 Trong đú: N: số lượng tế bào/ml
m: số tế bào trung bỡnh của 8 ụ tb: độ pha loóng
V: Tổng thể tớch trong buồng đếm
3.3.4. Phương phỏp lấy tế bào Lympho B của chuột
Theo phương phỏp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha, 2000) [19]. Giết chuột đó được gõy miễn dịch bằng khỏng nguyờn FSH, khử trựng chuột bằng cồn 700. Tỏch lấy thựy lỏch và cỏc hạch vào đĩa petri cú sẵn 10ml
dung dịch PBS. Dựng kộo cắt lỏch và cỏc hạch thành từng mảnh nhỏ, dựng kẹp gạt nhẹ để cỏc tế bào rời nhau ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống ly tõm, dựng pipet pasteur hỳt lờn, đẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. Để dung dịch lắng cặn, hỳt lấy dung dịch tế bào sang một ống ly tõm khỏc. Ly tõm dung dịch tế bào ở tốc độ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Sau đú loại bỏ hết dịch nổi và hũa cặn tế bào trong 10ml PBS. Lặp lại thao tỏc này 3 lần, lần cuối cựng hũa cặn tế bào với DMEM cú bổ sung 10% FBS sao cho cú mật độ tế bào 108 tế bào/ml.
3.3.5. Nuụi cấy tế bào Myeloma dũng Sp2/0 và P3X
a. Đỏnh thức và nhõn nuụi tế bào Sp2/0 và P3X
Chuyển ống tế bào từ trong Nito lỏng vào cốc nước cú nhiệt độ 360 – 370C. Khi dung dịch bờn trong ống cất đó tan đỏ hoàn toàn, lau khử trựng phớa ngoài bằng cồn 700. Chuyển dung dịch bờn trong ống sang một ống ly tõm, tiến hành ly tõm với tốc độ 1000 vũng/ phỳt trong 5 phỳt. Gạn bỏ lớp dịch nổi chứa DMSO. Hũa tan cặn tế bào bằng mụi trường nuụi cấy rồi chuyển tế bào sang chai nuụi cấy thớch hợp. Sau đú để chai nuụi vào tủ ấm 370C, 5% CO2.
Sau khi tế bào được đỏnh thức thành cụng, phỏt triển bỡnh thường, khụng bị nhiễm khuẩn, nhõn nuụi để đạt được lượng tế bào cần thiết 104 – 105 tế bào/ml mụi trường nuụi cấy. Trung bỡnh sau 2 – 3 ngày mụi trường phải được thay mới. Vỡ lỳc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phỏt triển tế bào đó thay đổi. Nếu mụi trường khụng được thay đỳng lỳc, tế bào sẽ chết. Để thay mụi trường trước hết cần ly tõm, hỳt bỏ mụi trường cũ, tiếp đú đưa từ 5 – 7 ml mụi trường nuụi cấy phự hợp. Để tủ ấm 370C, 5%CO2 và tiếp tục nuụi. b. Bảo quản tế bào trong nitơ lỏng
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trờn 95%, khụng bị nhiễm tạp nấm, vi khuẩn. Đổ bỏ mụi trường cũ thay vào đú la mụi trường mới, dựng pipet hỳt lờn đẩy xuống nhẹ nhàng cho tế bào rời đều trong mụi trường. Hỳt dung dịch
tế bào sang ống ly tõm, ly tõm ở 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Gạn bỏ dịch nổi, hũa cặn tế bào với mụi trường 10% FBS và 5%DMSO, cho dung dịch này vào trong ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi đạt được – 250C thỡ đưa nhanh ống cất vào lạnh -700C, sau 20 giờ chuyển vào bỡnh nitơ lỏng.
3.3.6. Dung hợp tế bào và tỏch dũng
3.3.6.1. Dung hợp
Hỗn dịch tế bào Lympho B (nồng độ 106/ml) được đưa vào phối hợp với tế bào Myeloma dũng Sp2/0 và P3X. Sau đú cho thờm vào 1 ml PEG khuấy kỹ trong 1 phỳt, 5 phỳt sau thờm vào 3,5ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT và ủ qua đờm ở 370C, 5% CO2, ly tõm hỗn dịch tế bào, hũa cặn vào 30ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT và phõn phối vào cỏc giếng của đĩa nhựa Falcon 0,1 ml. Sau dung hợp từ 5 – 7 ngày thờm vào mỗi giếng 0,1ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi và dựng phản ứng ELISA để phỏt hiện khỏng thể mong muốn.
Chọn tế bào từ cỏc giếng cú hiệu giỏ khỏng thể cao để tỏch dũng.
3.3.6.2. Tỏch dũng
Sau khi kiểm tra khả năng tạo khỏng thể bằng ELISA, ta biết được giếng nào cú khỏng thể, tuy nhiờn đõy là khỏng thể đa dũng do nhiều dũng tế bào lai tạo thành. Để cú khỏng thể đơn dũng ta phải tiến hành tỏch dũng như sau:
- Chọn một giếng mà dịch nổi cú hiệu giỏ khỏng thể cao nhất trộn đều cỏc tế bào trong giếng đó chọn thành hỗn dịch tế bào thuần nhất. Hỳt hỗn dịch tế bào sang ống ly tõm cú chứa mụi trường phỏt triển để pha loóng tế bào sao cho nồng đọ chỉ đạt 1 tế bào/100àl.
- Chuyển tế bào đó pha loóng sang nuụi trong cỏc giếng đó cú tế bào nuụi, sau đú chuyển vào nuụi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện tiờu chuẩn.
- Sau khi tế bào phỏt triển tốt (gần kớn đỏy), kiểm tra lại hiệu giỏ khỏng thể. Chọn ra giếng cú hiệu giỏ khỏng thể cao nhất nhõn lờn với lượng lớn để
bảo quản hoặc tiờm vào ổ bụng chuột, thu dịch bỏng.
3.3.7. Phương phỏp ELISA
Nguyờn lý: Dựng khỏng thể (khỏng thể 1) liờn kết với khỏng nguyờn sau đú liờn kết với khỏng thể 2 - gắn enzym, tiếp đú cho cơ chất vào, cơ chất sẽ bị enzym tỏc động tạo nờn màu (do enzym phõn hủy cơ chất).
Phản ứng ELISA giỏn tiếp gồm cỏc bước sau:
1- Phủ bản bằng 100àl khỏng nguyờn FSH trong coating buffer ở 40C qua đờm (nồng độ khoảng 125ng KN/giếng). Khỏng nguyờn FSH sẽ gắn cố định trờn bề mặt của bản. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer để loại bỏ những khỏng nguyờn khụng gắn vào bề mặt bản. Che chắn bản bằng 300àl Washing buffer + 1% Skim milk trong 1h ở 370C. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer.
2- Bổ sung khỏng thể 1 (dịch nổi của mụi trường nuụi cấy ) đó pha loóng 5000 lần bằng Washing buffer + 1% sữa. Ủ ở 370C trong 1h. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer loại bỏ những khỏng thể khụng liờn kết đặc hiệu với khỏng nguyờn.
3- Đưa vào mỗi giếng 100àl khỏng thể 2 gắn enzym peroxidase được pha loóng 10000 lần trong đệm Washing buffer + 1% sữa. Đem ủ bản ở 370C trong 1h. Rửa bản 10 lần bằng Washing buffer.
4- Đưa vào mỗi giếng 100àl dung dịch cơ chất TMB. Ủ bản ở 370C trong 10 phỳt.
5- Dừng phản ứng bằng cỏch bổ sung 50àl H2SO4 1N. 6- Đo giỏ trị OD450 (mật độ quang học ) bằng ELISA reader.
PHẦN THỨ TƯ
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRấNCHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYấN FSH CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYấN FSH
Trong sản xuất khỏng thể đơn dũng, việc tỡm ra liều lượng khỏng nguyờn thớch hợp để gõy được đỏp ứng miễn dịch cho chuột là rất quan trong. Đõy là tiền đề cho việc thu nhận tế bào lympho B sản sinh khỏng thể mong muốn. Tế bào lympho B là yếu tố khụng thể thiếu để tạo dũng tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng sau này.
Trong thớ nghiệm của chỳng tụi, sỏu chuột cỏi BALB/c 6 tuần tuổi được chia làm ba lụ thớ nghiệm và gõy miễn dịch với cỏc liều khỏng nguyờn FSH khỏc nhau:
Lụ 1 gồm chuột số 1.1 và 1.2 sử dụng liều 0,05 àg/con/lần
Lụ 2 gồm chuột số 2.1 và 2.2 sử dụng liều 0,1 àg/con/lần
Lụ 3 gồm chuột số 3.1 và 3.2: 0,2 àg/con/lần
Sau thời gian gõy miễn dịch cho chuột theo quy trỡnh gõy miễn dịch đó được trỡnh bày ở phần phương phỏp, chỳng tụi tiến hành lấy mẫu mỏu của từng chuột thớ nghiệm và tỏch huyết thanh để đỏnh giỏ đỏp ứng miễn dịch thụng qua xỏc định nồng độ của khỏng thể trong huyết thanh bằng phương phỏp ELISA giỏn tiếp.
Để tiến hành phản ứng ELISA giỏn tiếp cần phải cú 4 yếu tố sau: khỏng nguyờn đó biết, khỏng thể 1 cần kiểm tra, khỏng thể 2 gắn enzym và cơ chất hiện mầu. Quan sỏt màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tỏc dụng của enzyme.
Trong cỏc thớ nghiệm được thực hiện, chỳng tụi sử dụng cơ chất là TMB, enzym gắn khỏng thể là peroxydase. Khi cơ chất và enzym gặp nhau
thỡ phản ứng sinh màu xanh da trời, màu vàng xuất hiện khi dừng phản ứng bằng H2SO4. Kết quả của phản ứng ELISA (giỏ trị OD) được đo ở bước súng 450 nm bằng mỏy Microplate Reader (BioRad) nhằm kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng đặc hiệu khỏng nguyờn FSH.
Kết quả phản ứng ELISA xỏc định tương đối hàm lượng khỏng thể khỏng FSH trong huyết thanh được trỡnh bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả gõy đỏp ứng miễn dịch cho chuột Chuột thớ nghiệ m Chuột số 1.1 Chuột số 1.2 Chuột số 2.1 Chuột số 2.2 Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 ĐC õm (BSA) Giỏ trị OD 2,255 1,905 1,785 1,653 2,345 2,578 0,602 2,194 1,986 1,848 1,549 2,517 2,603 0,548 2,248 2,139 1,705 1,498 2,502 2,591 0,573 2,232± 0,033 2,010± 0,118 1,779± 0,072 1,567± 0,079 2,455± 0,095 2,590± 0,013 0,574± 0,027
Ghi chỳ: BSA (bovine serum albumin)
Kết quả bảng 4.1 cho thấy:
Với liều 0,05 àg FSH/con/lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra của chuột số 1.1 là 2,232 ± 0,033, của chuột số 1.2 là 2,010 ± 0,118
Với liều 0,1 àg FSH/con/lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra của chuột số 2.1 là 1,779 ± 0,072, của chuột số 2.2 là 1,567 ± 0,079
Với liều 0,2 àg FSH/con/lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra của chuột số 3.1 là 2,455 ± 0,095, của chuột số 3.2 là 2,590 ± 0,013
Giỏ trị OD phản ỏnh hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật độ quang học càng lớn – giỏ trị OD càng lớn (tức là màu xanh càng đậm) thỡ lượng khỏng thể được giữ lại càng nhiều, điều này chứng tỏ